巨噬细胞吞噬试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：8 作者：生物检测中心

巨噬细胞吞噬试验：揭示先天免疫卫士的核心功能

巨噬细胞，作为先天免疫系统的核心效应细胞，其强大的吞噬能力是机体清除病原体、凋亡细胞和异物的第一道防线。巨噬细胞吞噬试验是体外评估巨噬细胞这一关键功能的经典方法，广泛应用于免疫学、微生物学、肿瘤学及药物研发等领域。

一、核心原理

吞噬作用是一个主动、耗能的过程，主要包括以下几个步骤：

  1. 识别与附着： 巨噬细胞通过其表面的模式识别受体（如Toll样受体TLRs）、清道夫受体、补体受体（如CR3）、Fc受体（如FcγRI, FcγRIIA）等，识别目标物（如病原体、调理素包被的颗粒、凋亡细胞）表面的特定分子模式（PAMPs/DAMPs）或调理素（如抗体IgG、补体C3b）。
  2. 信号转导与肌动蛋白重组： 受体与配体结合后触发胞内信号级联反应，导致肌动蛋白细胞骨架在接触部位发生聚合重组。
  3. 内吞与吞噬体形成： 细胞膜内陷、延伸，最终包裹目标物形成吞噬小泡——吞噬体。
  4. 吞噬体成熟： 吞噬体与溶酶体融合形成吞噬溶酶体，内部酸性环境及多种水解酶（蛋白酶、核酸酶、溶菌酶等）、活性氧（ROS）、活性氮（RNS）共同作用，降解被吞噬的物质。
  5. 残余物质排出： 未被完全消化的残渣可能通过胞吐作用排出细胞。
 

二、常用实验方法

根据目标物标记方式和检测手段的不同，吞噬试验主要有以下几种常用方法：

  1. 显微镜观察法 (定性/半定量)：

    • 目标物： 酵母聚糖颗粒（酵母细胞壁成分，易被识别）、乳胶微球（常用直径1-3 μm）、荧光标记的细菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）、荧光标记的调亡细胞（如Jurkat细胞经紫外照射诱导调亡）。
    • 操作：
      1. 分离并制备巨噬细胞（如从小鼠腹腔灌洗、骨髓诱导分化、细胞系如RAW 264.7、THP-1）。
      2. 将巨噬细胞接种于培养板或盖玻片上，贴壁。
      3. 加入标记好的目标物（需优化数量比例，如细胞：颗粒=1：10-100），在37°C，5% CO2培养箱中共孵育一定时间（通常30分钟至2小时）。
      4. 洗涤： 用预温的PBS或培养基轻柔洗涤数次，去除未被吞噬的游离目标物（此步骤对准确性至关重要）。
      5. 固定与染色： 固定细胞（如4%多聚甲醛），如需增强对比，可用染料（如吉姆萨染液、结晶紫）对细胞核或细胞质进行染色。若目标物本身带荧光（如FITC标记的细菌/微球），此步可省略染色。
      6. 镜检： 在光学显微镜或荧光显微镜下观察。计数一定数量（通常100个）的巨噬细胞，记录吞噬了至少一个目标物的细胞数（吞噬率%）或计算平均每个巨噬细胞吞噬的目标物数量（吞噬指数）。
    • 优点： 直观可视，设备要求相对较低。
    • 缺点： 操作步骤多，人为计数可能存在偏差，通量低。

  2. 流式细胞术检测法 (定量、高通量)：

    • 目标物： 最常用荧光标记（如FITC, pHrodo™ Green/Red）的颗粒（乳胶微球、大肠杆菌等）或调亡细胞（常用CFSE或Annexin V-FITC标记）。
    • 操作：
      1. 巨噬细胞与荧光标记的目标物共孵育（同上）。
      2. 孵育结束后，立即用预冷的PBS洗涤以终止吞噬。
      3. 加入适量胰蛋白酶（针对贴壁细胞）或直接收集悬浮细胞。
      4. 用含荧光淬灭剂（如台盼蓝、伊文思蓝）或仅能淬灭细胞外荧光的试剂（如Trypan Blue）处理细胞，以区分附着于细胞表面和真正被内化的荧光信号。或者，在固定后进行流式检测时，表面附着的荧光信号强度通常远低于内化的信号。
      5. 流式细胞仪检测。巨噬细胞通常可通过其自身散射光（FSC/SSC）或特定表面标志物（如F4/80, CD11b）设门。分析目标荧光通道的阳性细胞比例（吞噬率%）和荧光强度（平均吞噬量）。
    • 优点： 快速、客观、定量、可同时分析大量细胞，能区分附着和内化。
    • 缺点： 需要流式细胞仪，对目标物荧光标记要求高，淬灭步骤需优化。

  3. 酶标仪比色法/荧光法 (批量定量)：

    • 原理： 利用目标物携带的标记物（如辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP、荧光素）被吞噬后，在细胞内溶酶体环境中仍保持活性（或pH敏感的荧光染料在酸性吞噬溶酶体中荧光增强）。
    • 操作：
      1. 巨噬细胞与标记的目标物共孵育。
      2. 洗涤去除游离目标物。
      3. 裂解细胞。
      4. 在裂解液中加入对应底物（如TMB底物用于HRP，DDAO磷酸酯用于AP，或直接读取荧光信号）。
      5. 酶标仪测量吸光度（OD值）或荧光强度（RFU）。数值高低与吞噬的目标物数量成正比。
    • 优点： 适用于高通量筛选（如药物筛选），操作相对简便。
    • 缺点： 无法区分单个细胞的吞噬差异，标记物在溶酶体环境中的稳定性需验证，背景干扰需控制。
 

三、关键实验因素与优化

  • 巨噬细胞状态： 活化状态（静息M0、经典活化M1、替代活化M2）显著影响吞噬能力。需明确细胞来源、分化/活化条件（如LPS+IFN-γ促M1, IL-4促M2）。
  • 目标物选择与调理： 目标物类型、大小、浓度、标记方式（荧光染料、酶）需根据实验目的选择。使用血清（含调理素）或不含血清的培养基会影响吞噬效率（尤其对于非调理目标物）。可人为添加特异性抗体（调理作用）进行研究。
  • 孵育条件： 温度（必须37°C，低温抑制吞噬）、时间、细胞与目标物的比例需要预实验优化。时间过长可能导致被吞噬物被降解或排出。
  • 洗涤步骤： 彻底去除未被吞噬的目标物是减少假阳性的关键。洗涤次数、力度需平衡去除游离物和保护细胞。
  • 对照设置：
    • 阴性对照： 巨噬细胞单独孵育（无目标物），用于设定背景阈值。
    • 吞噬抑制对照： 在4°C下孵育（能量依赖抑制），或使用细胞松弛素D（抑制肌动蛋白聚合），用于确认观察到的现象是主动吞噬而非非特异性附着。
    • 调理作用对照： 比较使用/未使用调理素（如血清、特异性抗体）处理目标物后的吞噬效率差异。
 

四、重要应用领域

  1. 基础免疫学研究： 阐明吞噬作用的分子机制（受体、信号通路）、调控因素（细胞因子、趋化因子）以及巨噬细胞不同活化状态对其功能的影响。
  2. 病原体-宿主互作： 评估不同病原体（细菌、真菌、寄生虫）逃避或利用巨噬细胞吞噬的机制，研究抗感染免疫应答。
  3. 自身免疫与炎症疾病： 研究巨噬细胞清除调亡细胞（efferocytosis）功能缺陷在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等疾病中的作用。
  4. 肿瘤免疫学： 评估肿瘤相关巨噬细胞的吞噬功能（通常被抑制），研究肿瘤微环境对巨噬细胞的驯化作用。探索增强巨噬细胞吞噬肿瘤细胞能力的免疫治疗策略（如CD47抗体阻断“别吃我”信号）。
  5. 纳米医学与药物递送： 评价纳米颗粒、药物载体等被巨噬细胞吞噬清除的效率，优化其设计以减少非特异性摄取，或利用巨噬细胞进行靶向递送。
  6. 生物材料相容性： 评估植入生物材料引发巨噬细胞吞噬反应的程度，预测其体内炎症反应和异物反应。
  7. 药物筛选与评价： 筛选能够增强（如用于抗感染、肿瘤免疫治疗）或抑制（如用于控制过度炎症）巨噬细胞吞噬功能的化合物或生物制剂。
 

五、总结

巨噬细胞吞噬试验是研究巨噬细胞核心免疫功能不可或缺的工具。从经典的光镜观察到现代的流式、酶标检测，多种方法为不同研究需求提供了选择。精确的实验设计、严格的对照设置和关键步骤的优化是获得可靠结果的基础。该试验在揭示免疫防御机制、疾病发生发展过程以及开发新型治疗策略方面持续发挥着重要作用。随着成像技术（如高内涵成像、活细胞成像）和分子生物学工具的发展，对吞噬作用这一复杂生命过程的解析将更加深入和精确。

参考文献：

  1. Gordon, S., & Plüddemann, A. (2017). Tissue macrophage heterogeneity and function. Nature Reviews Immunology, 17(3), 162–168.
  2. Aderem, A., & Underhill, D. M. (1999). Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology, 17(1), 593–623.
  3. Flannagan, R. S., Jaumouillé, V., & Grinstein, S. (2012). The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 7(1), 61–98.
  4. Rosales, C., & Uribe-Querol, E. (2017). Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity. BioMed Research International, 2017, 9042851.
  5. Korns, D., Frasch, S. C., Fernandez-Boyanapalli, R., Henson, P. M., & Bratton, D. L. (2011). Modulation of macrophage efferocytosis in inflammation. Frontiers in Immunology, 2, 57.
底部图片-PC版 底部图片-移动版