原代细胞制备与培养

发布时间：2025-06-14 11:33:56 阅读量：6 作者：生物检测中心

原代细胞制备与培养技术指南

一、 原代细胞：生命科学研究的基础

原代细胞是指直接从活体组织（人或动物）中分离获得，并在体外进行首次培养的细胞。相较于永生化细胞系，原代细胞最大程度地保留了来源组织的生理、生化和遗传特征，包括：

  • 生理相关性高： 反映体内真实的细胞行为、信号通路和代谢状态。
  • 遗传背景完整： 未经历体外永生化导致的基因突变或染色体不稳定。
  • 组织特异性强： 表达来源组织特异的标志物和功能。
  • 异质性存在： 更能代表体内不同细胞类型共存的复杂微环境。

应用价值：

  • 基础研究： 细胞分化、信号转导、代谢调控、衰老机制等。
  • 疾病建模： 研究肿瘤发生发展、神经退行性疾病、代谢性疾病等。
  • 药物筛选与毒性评价： 评估药物疗效、代谢动力学及器官特异性毒性，结果更接近临床。
  • 再生医学： 干细胞研究、组织工程种子细胞的来源。
  • 个性化医疗： 利用患者自身原代细胞进行个体化药物反应测试。

二、 原代细胞的制备：精密分离的艺术

  1. 组织来源获取：

    • 来源： 手术切除组织（肿瘤、病变器官）、活检组织、胚胎/胎盘组织、实验动物器官（肝、肾、脑、肺、皮肤等）。伦理审批（人源）和动物福利规范（动物源）是首要前提。
    • 转运： 组织离体后需立即置于预冷的、含高浓度抗生素（如青霉素/链霉素）和抗真菌剂（如两性霉素B）的专用组织保存液或基础培养基中，冰上快速转运至实验室。延迟或不当操作会显著降低细胞活力。

  2. 组织处理与解离：

    • 初步处理：
      • 在生物安全柜内无菌操作。
      • 去除多余的非目标组织（脂肪、结缔组织、坏死区域、血管）。
      • 用预冷的平衡盐溶液（如D-PBS）反复冲洗，尽可能去除血液、污染物。
      • 将组织剪成小块（1-3 mm³），增大接触面积。
    • 解离方法（常联合使用）：
      • 机械解离：
        • 剪切/研磨： 使用无菌手术剪、刀片反复剪切，或使用无菌研磨器皿研磨组织块。
        • 筛网过滤： 将剪切或初步酶解后的悬液通过孔径递减的细胞筛（如100μm → 70μm → 40μm）过滤，去除大块组织碎片和团块，收集单细胞或小细胞团悬液。操作轻柔避免损伤细胞。
      • 酶学解离（核心步骤）：
        • 常用酶： 根据组织类型选择（常需优化）：
          • 胶原酶 (Collagenase)： I-IV型，特异性水解胶原蛋白（结缔组织主要成分），尤其适于富含胶原的组织（肝、肿瘤、乳腺）。
          • 胰蛋白酶 (Trypsin)： 作用于细胞间粘附蛋白，作用强但可能损伤膜蛋白，常与EDTA联用（螯合Ca²⁺/Mg²⁺减弱细胞粘附）。需严格控制浓度和时间，及时用含血清培养基中和。
          • 中性蛋白酶 (Dispase)： 温和切割细胞间基质蛋白，对细胞表面蛋白损伤小，常用于表皮细胞、神经细胞分离。
          • 透明质酸酶 (Hyaluronidase)： 降解透明质酸（细胞外基质成分），常与其他酶联用。
          • DNA酶 (DNase I)： 消化因细胞破裂释放的DNA，减少悬液粘稠度，防止细胞成团。常在酶解后期加入。
        • 操作要点：
          • 将组织小块置于酶溶液中（37°C水浴或培养箱中孵育），持续温和搅拌（磁力搅拌器或手动摇晃）。
          • 时间控制至关重要！ 每隔一段时间取样镜检观察解离程度，避免过度消化损伤细胞。通常需要30分钟至数小时。
          • 消化终止：加入含5-10%胎牛血清（FBS）的完全培养基（FBS富含酶抑制剂），冰浴或离心去除残留酶。

  3. 细胞悬液纯化与清洗：

    • 离心： 将细胞悬液以较低转速（如200-300g，4-8°C）离心5-10分钟，弃上清（含酶、碎片）。
    • 洗涤： 用预冷的平衡盐溶液或基础培养基重悬细胞沉淀，再次离心，重复1-2次，彻底去除残留酶液、细胞碎片、红细胞和死亡细胞。
    • 红细胞裂解（可选择）： 若样本含大量红细胞，可用专用的红细胞裂解液短暂处理（严格按说明操作），之后立即用大量培养基洗涤终止裂解。
    • 密度梯度离心（特定需求）： 对于需要高度富集特定细胞类型（如淋巴细胞、胰岛细胞），可使用如Percoll、Ficoll等密度梯度介质进行离心分离，不同密度的细胞分布在特定层面。

  4. 细胞计数与活力检测：

    • 台盼蓝染色排除法： 最常用。台盼蓝不能穿透活细胞膜，死细胞被染成蓝色。计算活细胞比例（活力%）和细胞浓度（cells/mL）。注意： 原代细胞通常大小形态不均一，计数需谨慎。
    • 自动细胞计数仪： 效率高，但需注意其对细胞团块的识别可能不准。
    • 目标： 获得高活力（通常>85-90%）的单细胞悬液或小细胞团，确定接种密度。

三、 原代细胞培养：模拟体内的微环境

  1. 培养基与添加物：

    • 基础培养基： 选择适合组织来源的基础培养基（如DMEM高糖、DMEM/F12、RPMI 1640、MEM等）。
    • 血清： 胎牛血清 (FBS) 仍是常用添加物（5-20%），提供生长因子、激素、粘附因子、营养物质及蛋白酶抑制剂。注意事项：
      • 批次差异显著，需预实验筛选。
      • 存在引入外源因子或病原体风险。
      • 成分复杂，不利于机制研究。
    • 无血清/限定培养基 (SFM/CDM)： 日益重要。由基础培养基添加必需的生长因子（如EGF, FGF-basic）、激素（如胰岛素、氢化可的松）、载体蛋白（如转铁蛋白、白蛋白）、微量元素、脂质等配制而成。优点：成分明确、减少批次差异、降低污染风险、有利于下游纯化分析。但需针对特定细胞类型进行优化和验证。
    • 必需添加物： 抗生素（青霉素/链霉素）、抗真菌剂（如在分离阶段使用后，培养时可降低浓度或不用）、L-谷氨酰胺（细胞能量和氮源）、缓冲系统（HEPES有助于pH稳定）。

  2. 基质包被：

    • 目的： 提供细胞粘附、铺展、迁移、分化和存活的物理支撑和生化信号。
    • 常用包被物：
      • 胶原蛋白 (Collagen)： I型（最常用，源自鼠尾或牛腱）、IV型（基底膜成分）。模拟天然基质。
      • 层粘连蛋白 (Laminin)： 基底膜主要成分，对上皮细胞、内皮细胞、神经细胞粘附和分化至关重要。
      • 纤维连接蛋白 (Fibronectin)： 促进细胞粘附和铺展。
      • 人工合成多肽： 如聚-D-赖氨酸 (PDL) / 聚-L-赖氨酸 (PLL)，带正电荷促进细胞（尤其是神经细胞）粘附；RGD肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）模拟粘附蛋白关键序列。
    • 操作： 将包被物溶解于适当溶剂（如弱酸、无血清培养基或平衡盐溶液），加入培养器皿中覆盖底面，室温或37°C孵育一段时间（如30min-2h），使用前吸弃多余液体（有时需PBS冲洗）。

  3. 接种与培养条件：

    • 接种密度： 关键参数！ 密度过低会导致生长缓慢甚至死亡；过高易导致过快接触抑制或营养耗尽。需根据细胞类型、活力、组织来源经验性优化（通常在10⁴ - 10⁶ cells/cm²范围）。
    • 培养器皿： 根据需要选择培养瓶、培养皿或多孔板。新制备的原代细胞建议使用小规格器皿（如6孔板、35mm皿）。
    • 培养环境：
      • 温度： 哺乳动物细胞通常为37°C ± 0.5°C。
      • 气体： 5% CO₂（维持培养基pH在7.2-7.4），95% 空气湿度（饱和湿度）。某些细胞（如神经细胞、精原细胞）可能需不同氧分压（如3-5% O₂）。
      • 无菌： 全程严格无菌操作（生物安全柜、无菌试剂耗材、规范操作）。

  4. 换液与维持：

    • 首次换液： 接种后24-72小时进行（依细胞贴壁速度而定），去除未贴壁细胞、死细胞碎片和残留酶。动作轻柔，避免冲起已贴壁细胞。
    • 常规换液： 根据细胞生长速度和培养基消耗情况，一般每1-3天更换一次新鲜培养基（更换50-100%）。密切观察培养基颜色（酚红指示剂：偏红→碱性，偏黄→酸性）、浑浊度。
    • 观察： 每日显微镜下观察细胞形态、贴壁情况、生长密度、有无污染迹象（真菌菌丝、细菌浑浊、pH异常下降）。

四、 原代细胞鉴定与质量控制

  1. 形态学观察：

    • 显微镜下观察细胞形态（上皮样、成纤维样、内皮样、神经元样等）、大小、均一性、生长方式（铺路石状、漩涡状）。

  2. 免疫细胞化学/免疫荧光 (ICC/IF)：

    • 金标准方法。 使用针对特定细胞类型标志物的特异性抗体进行染色（如角蛋白-上皮细胞、波形蛋白-间充质细胞、CD31-内皮细胞、胶质纤维酸性蛋白-GFAP-星形胶质细胞、神经元特异核蛋白-NeuN-神经元），通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察定位和表达。DAPI染核定位细胞。

  3. 流式细胞术 (FCM)：

    • 快速定量分析细胞群体中特定标志物的表达比例，评估细胞纯度和异质性。可同时检测多个表面或胞内标志物。

  4. RT-PCR / qRT-PCR：

    • 检测特定组织或细胞类型相关基因的mRNA表达（如Alb-肝细胞、Ins2-胰岛β细胞、Tubb3-神经元）。

  5. 功能检测：

    • 根据细胞类型进行特定功能验证（如肝细胞：尿素合成、药物代谢酶活性；心肌细胞：自发搏动；神经细胞：电生理活性；免疫细胞：吞噬、增殖、细胞因子分泌）。

五、 挑战、注意事项与优化策略

  • 污染控制： 细菌、真菌、支原体是主要威胁。严格执行无菌操作、使用抗生素/抗真菌剂（但非万能）、定期检测（尤其是支原体）。
  • 细胞活力低： 优化组织解离方案（酶类型、浓度、时间、温度）；确保组织新鲜、快速处理；减少机械损伤；优化培养基和包被条件。
  • 细胞不贴壁/贴壁差： 优化基质包被类型和浓度；检查血清批次质量；确认接种密度合适；确保培养基pH和渗透压正确。
  • 成纤维细胞污染： 原代培养普遍问题。策略：优化分离方法减少其混入；利用贴壁速度差异（差速贴壁法）；使用无血清培养基（某些成纤维细胞依赖血清）；物理刮除法（针对局部污染）；选择性抑制剂（需谨慎，可能影响目标细胞）。
  • 增殖缓慢/衰老早： 原代细胞本身有限分裂能力（Hayflick极限）。优化培养条件（生长因子、低氧环境）；选择更“年轻”的来源组织；尝试条件重编程（Conditional Reprogramming, CR）等技术短期扩增。
  • 批次间差异： 不同供体组织固有的生物学差异（物种、年龄、性别、健康状况）。需在研究中设置生物学重复并评估变异性。
  • 标准化困难： 制备过程复杂，影响因素多。建立详细的标准化操作规程(SOP)，尽可能控制变量（酶批次、血清批次、操作人员、时间点）。

六、 常见问题解答 (FAQ)

  • Q: 原代细胞能传多少代？
    • A: 因细胞类型、来源、培养条件而异。一般有限代数（如3-10代），随后增殖减慢、形态改变、功能丧失（衰老）。永生化细胞系理论上可无限传代。
  • Q: 原代细胞必须用血清培养吗？
    • A: 非必须，但FBS目前仍是许多原代细胞培养的便利选择，尤其初始分离和扩增。无血清/限定培养基是趋势和研究深入的要求。
  • Q: 如何判断原代细胞是否被污染？
    • A: 显微镜观察（细菌：微小移动颗粒；真菌：菌丝/孢子；支原体：需染色或专用检测）；培养基突然浑浊、pH异常快速降低（变黄）；细胞状态突然变差且换液无效。定期检测（尤其支原体）很重要。
  • Q: 胶原酶浓度越高、时间越长越好吗？
    • A: 绝对不是！ 过度酶消化是导致细胞活力下降的主要原因之一。必须通过预实验确定特定组织所需的最低有效浓度和最短时间，并密切镜检监控。
  • Q: 为什么我的原代细胞长满了却不像文献里的形态？
    • A: 原代细胞形态受多种因素影响：组织来源差异、分离方法、培养基组分（尤其血清批次）、包被物、接种密度、污染、细胞状态（健康/衰老）等。需仔细排查，并与标准图片对比。

结论：

原代细胞培养是连接体外研究与体内真实生理病理状态的重要桥梁。掌握其复杂的制备和培养技术虽然充满挑战，但对于获得生理相关性高的研究数据必不可少。成功的原代培养依赖于对细节的关注：从组织获取的快速和无菌处理、酶解条件的精细优化、培养基和包被基质的合理选择，到培养过程的密切监控和严格的质量控制。随着无血清培养技术和新型培养系统（如3D培养、类器官）的发展，原代细胞的应用潜力将得到更深入的挖掘和更广泛的应用。持续的技术优化和标准化是推动该领域前进的关键。