细胞增殖及活性检测 - 中析研究所生物检测中心

细胞增殖及活性检测：原理、方法与意义

细胞增殖与活性是评估细胞健康状态、生理功能以及对药物或环境因子响应的核心指标。它们在基础生命科学研究（如发育生物学、肿瘤学、免疫学）和药物研发（如药效评价、毒性筛选）等领域至关重要。本文将系统性地介绍相关的检测原理、常用方法及选择策略。

一、核心概念与基本原理

细胞增殖： 指细胞通过有丝分裂增加数量的过程。检测核心是追踪DNA合成（如胸腺嘧啶类似物掺入）或细胞数量/生物量的动态变化。
细胞活性/细胞毒性： 指细胞维持基本生命活动的能力（活性）或受到损伤导致功能丧失/死亡的程度（毒性）。检测原理主要基于：
- 膜完整性： 活细胞膜完整，能选择性排斥特定染料（如台盼蓝）；死细胞膜受损，染料渗入。
- 代谢活性： 活细胞持续进行新陈代谢，可还原特定底物产生信号（如MTT、CCK-8）。
- 酶活性： 活细胞存在特定酶活性（如ATP依赖的荧光素酶反应）。
- 克隆形成能力： 反映单个细胞持续增殖形成克隆的潜力，是评价长期活力的金标准之一。

二、常用检测方法

(一) 细胞增殖检测

胸腺嘧啶类似物掺入检测 (BrdU / EdU检测)：
- 原理： 细胞分裂合成DNA时，将标记的胸腺嘧啶类似物（BrdU或EdU）掺入新合成的DNA链。
- BrdU检测： 通常使用抗BrdU抗体结合酶标或荧光标记的二抗进行检测（免疫法）。
- EdU检测： 利用点击化学反应（Click Chemistry），EdU上的乙炔基团与带有荧光标记的叠氮化物高效、共价结合。优势： 无需变性DNA，操作更简单快速，灵敏度高，背景低。
- 应用： 适用于培养细胞（微孔板、玻片）以及组织切片，可结合显微镜（定性/定量）或流式细胞术（定量分析S期细胞比例）。
代谢还原法 (MTT、XTT、CCK-8)：
- 原理： 活细胞线粒体内的脱氢酶能将水溶性四唑盐（如MTT、XTT、WST-8）还原为不溶于水的甲臜结晶（MTT）或水溶性的甲臜染料（XTT， CCK-8）。
- MTT法： 形成的甲臜结晶需溶解（常用DMSO）后测定吸光度（OD值）。OD值与活细胞数量（代谢活性）成正比。
- XTT/CCK-8法： 产生的甲臜染料水溶性好，可直接测定上清液OD值，操作更简便。CCK-8（主要成分为WST-8）是目前常用且灵敏度高的试剂。
- 应用： 广泛用于高通量药物筛选、细胞毒性测试、细胞增殖抑制/促进作用研究（96/384孔板）。
基于ATP的检测：
- 原理： ATP是细胞能量的直接来源，其含量与活细胞数量高度相关。荧光素酶在ATP、氧气和镁离子存在下催化荧光素氧化发光。
- 检测： 裂解细胞释放ATP，与荧光素酶/荧光素混合，测定产生的化学发光强度（RLU），与活细胞数量成正比。
- 优势： 灵敏度极高，线性范围宽，速度快，适用于各类细胞（尤其是悬浮细胞）。
- 应用： 细胞活性/毒性快速检测、高通量筛选。
直接细胞计数法：
- 血球计数板： 显微镜下人工计数特定体积内的细胞数（区分活/死需结合台盼蓝染色）。
- 自动化细胞计数器： 基于图像分析或库尔特原理（电阻抗法），可快速、客观地进行细胞计数和大小分析，通常也能区分活死细胞（结合荧光染料或阻抗差异）。
- 应用： 基础细胞培养监控、细胞传代前计数、需要精确细胞数的实验起点。
流式细胞术细胞周期分析：
- 原理： 利用核酸染料（如PI、7-AAD、DAPI、Hoechst）对细胞内DNA进行染色。处于细胞周期不同时相（G0/G1, S, G2/M）的细胞DNA含量不同，通过流式细胞仪检测荧光强度分布，可分析细胞群体的增殖状态（计算S期比例、增殖指数PI）。
- 优势： 提供细胞周期分布的详细信息，可同时结合其他参数（细胞表面标志物、凋亡标志物）进行多参数分析。
- 应用： 研究细胞周期调控机制、药物对细胞周期阻滞的影响。

(二) 细胞活性/细胞毒性检测

台盼蓝染色排除法：
- 原理： 台盼蓝染料不能透过活细胞完整的细胞膜；死细胞膜破损，染料进入细胞使其染成蓝色。
- 检测： 显微镜下观察或利用自动细胞计数器分辨未染色（活）和蓝色（死）细胞，计算活细胞百分比。
- 优势： 操作简便、快速、成本低。
- 局限： 主观性较强（显微镜计数），仅反映膜完整性瞬时状态，无法区分凋亡早期细胞（膜完整）。适用于粗略评估。
乳酸脱氢酶释放法 (LDH法)：
- 原理： 正常情况下LDH存在于胞浆内。细胞膜损伤后，LDH释放到培养上清液中。通过检测上清液中LDH催化反应产生的显色或荧光信号强度，反映细胞毒性程度。
- 优势： 非侵入性，仅需取上清检测，可连续监测（时间动力学）。
- 应用： 药物细胞毒性筛选、补体介导的细胞毒作用检测。
荧光素二乙酸酯/碘化丙啶双染色法 (FDA/PI)：
- 原理：
  - FDA（活细胞染色）： 本身无荧光，自由扩散进入细胞，被胞内酯酶水解产生绿色荧光的荧光素，积累在活细胞内。
  - PI（死细胞染色）： 不能透过完整细胞膜，可与死细胞或晚期凋亡细胞的DNA/RNA结合产生红色荧光。
- 检测： 荧光显微镜观察或流式细胞仪分析，可清晰区分活细胞（绿）、死细胞（红）以及中间状态细胞。
- 优势： 直观、可定量（流式），灵敏度较台盼蓝高。
Calcein-AM / PI双染色法：
- 原理：
  - Calcein-AM（活细胞染色）： 自由进入细胞，被胞内酯酶水解生成强绿色荧光的Calcein，保留在活细胞内。
  - PI（死细胞染色）： 同上。
- 检测与优势： 类似FDA/PI，Calcein荧光信号通常更强、更稳定，应用广泛。同样适用于荧光显微镜和流式细胞术。
克隆形成实验：
- 原理： 评估单个细胞持续增殖形成肉眼可见克隆（通常>50个细胞）的能力。该能力反映了细胞的长期生存、增殖活力和对处理（药物、辐射等）的抗性。
- 方法： 将低密度细胞接种于培养皿/板，处理或不处理，培养足够时间（通常1-3周）后染色（如结晶紫、吉姆萨），计数克隆数。
- 意义： 是评价细胞“再增殖”潜力的金标准，尤其适用于肿瘤细胞放疗/化疗敏感性研究和干细胞研究。

三、方法选择与注意事项

明确检测目标：
- 增殖速率？ 选择DNA合成检测（BrdU/EdU）、代谢还原法（CCK-8）、基于ATP检测或细胞周期分析。
- 即时活性/膜完整性？ 选择台盼蓝排除、LDH释放、FDA/PI、Calcein-AM/PI。
- 长期存活/克隆潜力？ 选择克隆形成实验。
- 细胞周期分布？ 选择流式细胞术细胞周期分析。
样本类型与通量：
- 高通量筛选： 首选基于微孔板的均质检测法（CCK-8、基于ATP、XTT、LDH）。
- 显微镜观察/形态学： 选择染色法（BrdU/EdU显微镜观察、台盼蓝、FDA/PI、Calcein-AM/PI）。
- 悬浮细胞： 基于ATP检测、流式细胞术、LDH法、台盼蓝（自动化计数）通常更优。
- 贴壁细胞： 大多数方法均适用，注意处理步骤（如MTT结晶溶解前需去除培养基）。
- 组织/体内？ BrdU/EdU可用于组织切片免疫组化；部分方法需优化或开发体内适用版本。
灵敏度、动力学范围与时间点：
- 高灵敏度： 基于ATP检测、EdU检测（结合高灵敏度成像/流式）。
- 宽线性范围： 基于ATP检测、CCK-8通常线性范围较好。
- 时间动力学： 需要连续监测毒性释放（如LDH），或评估不同时间点增殖（如代谢法、ATP法）。
干扰因素：
- 待测物特性： 检测试剂是否与待测药物/化合物存在化学相互作用（如某些化合物能直接还原MTT/WST-8导致假阳性活性）？是否影响检测酶的活性（如抑制LDH）？
- 细胞应激反应： 某些处理（如药物）可能暂时改变细胞代谢而不杀死细胞，影响代谢还原法（如MTT/CCK-8）结果解读。
- 细胞浓度： 确保细胞接种密度在检测方法的线性范围内，避免过度拥挤或过少影响结果。
- 培养条件： 培养基颜色（特别是酚红）、血清批次、pH值可能影响吸光度或荧光读数。
多重检测与终点确认：
- 由于单一方法可能存在局限性（如膜完整不代表代谢正常），建议结合使用不同原理的方法（如CCK-8 + LDH， Calcein-AM/PI + 形态学观察）相互验证，更全面评估细胞状态。
- 流式细胞术可实现多参数同时分析（如细胞周期+凋亡+特定蛋白表达）。
标准化与对照设置：
- 设立严格对照： 包括未处理细胞（空白对照/阴性对照）、已知致死剂量处理的细胞（毒性对照/阳性对照）、仅含培养基的孔（背景对照）。
- 实验重复： 至少进行3次独立生物学重复。
- 数据标准化： 通常将处理组数据表示为对照组（如未处理组）的百分比（如相对增殖率%，相对活性%）。

四、总结

细胞增殖与活性检测是生命科学研究的基石。从经典的台盼蓝染色到高灵敏度的基于ATP检测和便捷的CCK-8法，再到提供细胞周期信息的流式分析和评估长期潜能的克隆形成实验，多种方法各有千秋。研究者需深刻理解不同方法的基本原理、优势和局限性，紧密结合具体的研究问题、样本特点和实验条件进行审慎选择，并注意合理设置对照、排除干扰因素、进行多重验证。唯有如此，才能获得可靠、可重复的数据，准确解读细胞的行为和命运，推动科研发现和应用的进程。随着技术的发展，检测方法正朝着更高灵敏度、多参数同步化、自动化、活细胞实时动态成像及更贴近体内复杂微环境（如3D培养、类器官） 的方向不断演进。

重要安全提示：

实验操作需遵守实验室安全规范。
部分试剂（如DMSO、PI、EB、放射性同位素标记的胸腺嘧啶）具有潜在毒性或致突变性，应严格按规程操作、穿戴防护装备并进行废弃物专业处理。
涉及病毒感染细胞的实验需在相应生物安全等级（BSL）实验室进行。