流式细胞术

发布时间：2025-06-14 11:17:01 阅读量：9 作者：生物检测中心

流式细胞术：解码细胞的强大工具

流式细胞术是一种强大的技术，能够在极短时间内（每秒数千至上万个）对悬浮于液体中的单个细胞或微小颗粒进行多参数、高通量的物理和化学特性分析。其核心原理在于让细胞排成单列高速通过激光照射区，通过检测细胞与激光相互作用产生的信号来获取信息。

一、 核心技术原理

  1. 流体聚焦： 样本细胞悬液（鞘内样品）被高速流动的鞘液包裹，在流体动力学原理作用下被聚焦到流路中心，形成极细的单细胞流，确保细胞逐个通过检测点。
  2. 激光激发： 一束或多束特定波长的激光聚焦照射在单个细胞流上。
  3. 信号产生与收集：
    • 光散射 (Light Scatter):
      • 前向散射光 (Forward Scatter, FSC): 主要反映细胞的大小和相对大小。细胞越大，散射到前方小角度的光越强。
      • 侧向散射光 / 90度散射光 (Side Scatter, SSC): 主要反映细胞内部的颗粒性和复杂程度（如细胞核、胞质颗粒、细胞器）。内部结构越复杂，散射到90度方向的光越强。
    • 荧光发射 (Fluorescence Emission): 当细胞上结合有荧光标记物（如荧光染料偶联的抗体、荧光蛋白、核酸染料、活性染料等）时，激光激发这些荧光分子，使其发射出波长更长的荧光信号。这是流式细胞术进行多参数分析和特异性检测的基础。
  4. 信号检测与转换： 光电倍增管或光电二极管等检测器分别接收FSC、SSC和不同波长（通过滤光片分离）的荧光信号，并将其转换为电信号。
  5. 数据采集与分析： 电子系统将电信号放大、数字化，生成每个细胞多个参数的数据点（事件）。这些庞大的数据集通过专门的软件进行多维分析（如设门分析Gate Analysis、统计参数计算、细胞亚群分群等），最终以点图、等高线图、直方图等形式直观呈现结果。

二、 仪器基本构成

  1. 流体系统： 包含鞘液容器、样本管、加压装置和流动室（石英比色杯或喷嘴），确保样本稳定鞘流聚焦。
  2. 光学系统：
    • 激光光源： 提供单色性好的高强度激发光（常见波长如405nm、 488nm、 532nm、 561nm、 633nm/640nm）。
    • 透镜系统： 聚焦激光束到细胞流，并收集散射光和荧光信号。
    • 滤光片系统：
      • 分光镜/二向色镜： 反射特定波长以下的光，透过特定波长以上的光。
      • 带通滤光片： 只允许特定波长范围的光通过。
  3. 电子检测系统： 光电检测器（PMT/APD）、放大电路、模数转换器，将光信号转化为可处理的数字信号。
  4. 计算机与分析软件： 控制仪器运行、采集数据、进行复杂的数据分析和可视化。

三、 核心应用领域 （无特定产品示例）

  1. 免疫学：
    • 免疫表型分析： 鉴定和量化血液、组织或培养物中不同类型的免疫细胞（T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞等）及其活化状态、分化阶段。
    • 细胞分选 (FACS)： 基于特定标记分离高度均一的特定细胞亚群，用于下游分子生物学实验或治疗应用。
    • 细胞因子/信号通路分析： 检测细胞内细胞因子的产生或磷酸化蛋白等信号分子的活化状态。
    • HLA分型/交叉配型： 移植医学中的重要应用。
  2. 血液学：
    • 白血病/淋巴瘤免疫分型： 诊断、分类及微小残留病监测的金标准之一。
    • 造血干细胞计数： 骨髓或外周血干细胞移植前干细胞数量评估。
    • 网织红细胞计数及分群： 反映骨髓造血功能。
    • 阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断： 检测GPI锚连蛋白缺失。
  3. 肿瘤学：
    • 肿瘤细胞周期/DNA含量分析： 评估肿瘤细胞的增殖状态和倍体异常。
    • 肿瘤细胞凋亡检测： 检测早期和晚期凋亡细胞。
    • 循环肿瘤细胞检测： 富集和分析外周血中的稀有肿瘤细胞。
  4. 细胞生物学：
    • 细胞功能分析： 检测细胞活性、增殖、凋亡、坏死、自噬、线粒体膜电位、活性氧水平、钙离子流、pH值变化等。
    • 细胞信号转导： 分析细胞内信号分子的磷酸化状态。
    • 报告基因检测： 如GFP等荧光蛋白表达。
  5. 微生物学：
    • 细菌/真菌快速检测与活力分析。
    • 抗生素敏感性测试。
    • 环境微生物群落分析。
  6. 基础研究与药物开发：
    • 高通量药物筛选（靶点表达、功能变化）。
    • 作用机制研究。
    • 临床前药效/毒性评估。

四、 关键优势

  1. 高通量： 每秒可分析数千至上万个细胞，统计意义强。
  2. 多参数： 同时检测单个细胞的多个物理和化学指标（散射光和多种荧光）。
  3. 高灵敏度： 可检测细胞表面或内部的低丰度分子。
  4. 单细胞分辨率： 提供细胞群体的异质性信息。
  5. 客观定量： 结果以数字形式呈现，便于比较和分析。
  6. 活细胞分析： 可在保持细胞活性的状态下进行分析和分选。
  7. 功能强大： 兼具分析（获取信息）和分选（分离细胞）功能。

五、 实验流程要点

  1. 样本制备：
    • 制备单细胞悬液（血液、组织解离、培养细胞）。
    • 细胞活力检测与维持（通常使用活性染料排除死细胞）。
    • 荧光标记： 直接（荧光抗体）或间接（通过二抗）标记靶抗原。需注意抗体特异性、滴定优化、同型对照设置、荧光素选择和光谱叠加（补偿调节）。
    • 缓冲液选择（含蛋白缓冲液减少非特异性结合）。
    • 过滤去除细胞团块。
  2. 仪器设置与校准：
    • 使用标准微球进行光路校准和仪器性能验证。
    • 光电倍增管电压优化。
    • 单色样本调节补偿： 消除荧光通道间的光谱串扰，是准确分析多色实验的关键步骤。
  3. 数据采集： 设置触发阈值、获取所需数量的事件。
  4. 数据分析：
    • 设门策略： 通过FSC/SSC初步区分活细胞、碎片、细胞团块等。在此基础上，利用特异性荧光标记依次圈定目标细胞亚群。
    • 图形展示： 点图（Dot Plot）、等高线图（Contour Plot）、密度图（Density Plot）展示双参数关系；直方图（Histogram）展示单参数分布。
    • 统计分析： 计算各群细胞的百分比、荧光强度平均值/中位数、绝对计数（若使用计数微球）等。

六、 挑战与发展趋势

  1. 挑战：
    • 补偿复杂性： 荧光素数量增多导致补偿调节复杂度指数级上升。
    • 自发荧光干扰： 某些细胞（如巨噬细胞）或组织样本可能具有较强自发荧光。
    • 稀有事件检测： 需要特殊富集技术或高灵敏度仪器。
    • 数据分析： 高维数据（>15色）需要更高级的降维和聚类算法（如t-SNE, UMAP, PhenoGraph, FlowSOM）。
    • 样本制备标准化： 确保结果可靠性和可比性。
  2. 发展趋势：
    • 超高参数流式： 不断突破荧光素数量限制（>30色），实现更精细的免疫图谱绘制。
    • 质谱流式技术： 使用金属标签代替荧光素，彻底解决光谱重叠问题，参数扩展潜力巨大（>50参数）。
    • 成像流式技术： 在获取传统流式数据的同时，捕获每个细胞的显微图像，结合形态学信息。
    • 自动化与标准化： 自动化样本处理、上样和分析流程，提高通量和可重复性。
    • 人工智能与大数据分析： 利用机器学习算法深度挖掘高维流式数据，发现新的细胞亚群和生物标志物。
    • 小型化与便携式： 开发适用于床旁或现场检测的仪器。
    • 纳米颗粒与胞外囊泡分析： 扩展研究对象至更小的颗粒。

总结

流式细胞术作为一种成熟的单细胞分析技术，凭借其高通量、多参数、高灵敏度的优势，在生命科学研究和临床诊断的众多领域发挥着不可替代的核心作用。从基础免疫表型到复杂的细胞功能分析，再到前沿的肿瘤学和药物研发，流式技术持续推动着我们对细胞世界的理解。随着超高参数分析、质谱流式、成像流式等新技术的快速发展以及人工智能在数据分析中的深入应用，流式细胞术未来将在精准医疗、系统免疫学和单细胞组学研究中展现更广阔的前景和更强大的洞察力。