粘附实验

发布时间：2025-06-14 11:14:24 阅读量：5 作者：生物检测中心

细胞粘附实验：原理、步骤与分析

摘要： 细胞粘附是细胞与细胞外基质或其他细胞相互作用的基础生物学过程，广泛参与胚胎发育、组织修复、免疫反应及肿瘤转移等关键事件。本文详细介绍一种标准化的体外细胞-基质粘附实验方法，适用于评估不同处理条件或分子对细胞粘附能力的影响。

一、 实验原理

粘附实验的核心在于量化细胞在特定基质表面的附着能力。基本流程如下：

  1. 基质包被： 将目标基质蛋白（如纤维连接蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白等）溶液包被于固相载体（如96孔板）表面。
  2. 细胞接种： 将制备好的单细胞悬液接种到包被好的孔板中，在特定条件下（如37˚C, 5% CO₂）孵育一段时间。
  3. 移除未粘附细胞： 通过温和清洗（如PBS漂洗）去除未粘附或粘附不牢固的细胞。
  4. 粘附细胞定量： 利用不同方法（如结晶紫染色、MTT比色法、荧光染料标记等）对牢固粘附在基质上的细胞进行染色或标记，并测定其吸光度值（OD值）或荧光强度（RFU值）。
  5. 数据分析： 计算粘附细胞的比例或相对粘附率，比较不同实验组间的差异。

二、 材料与试剂

  • 细胞： 目标细胞系（如成纤维细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等）。
  • 包被基质： 纯化的细胞外基质蛋白溶液（常用浓度范围：1-20 µg/mL）。
  • 缓冲液：
    • 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
    • 细胞培养基（不含血清或含低浓度血清）
    • 清洗缓冲液（通常为PBS）
  • 固定液： 4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。
  • 染色液：
    • 选项1（结晶紫法）：0.1%或0.5%结晶紫溶液（溶于PBS或10%乙醇）。
    • 选项2（MTT法）：MTT试剂（最终工作浓度通常为0.5mg/mL）。
    • 选项3（荧光染料法）：如Calcein AM（工作浓度需优化）。
  • 溶解液：
    • 结晶紫法：1% SDS溶液或10%醋酸溶液。
    • MTT法：二甲基亚砜（DMSO）或含特定缓冲液的溶解液。
    • 荧光法：通常无需溶解液，直接检测荧光。
  • 仪器设备：
    • 细胞培养箱
    • 生物安全柜
    • 倒置显微镜（用于观察粘附情况）
    • 离心机
    • 酶标仪（用于检测吸光度或荧光强度）
    • 96孔培养板（平底，组织培养处理）
    • 移液器及无菌吸头
    • 计时器

三、 实验步骤

  1. 细胞准备：

    • 将目标细胞培养至对数生长期（约70-80%融合度）。
    • 吸弃培养基，用PBS轻柔漂洗细胞1-2次。
    • 加入适量胰蛋白酶溶液（不含EDTA或含低浓度EDTA）消化，显微镜下观察细胞变圆脱落。
    • 加入含血清的培养基（血清中和胰酶活性）终止消化，轻轻吹打形成单细胞悬液。
    • 将细胞悬液转移至离心管，离心（如1000 rpm, 5分钟）收集细胞。
    • 弃上清，用不含血清的培养基（或特定实验要求的缓冲液）重悬细胞，通过细胞计数调整细胞浓度至所需密度（通常在1×10⁵ - 5×10⁵ cells/mL范围）。
    • 将细胞悬液置于37˚C温育备用（避免长时间放置）。

  2. 基质包被：

    • 根据需要选择合适的细胞外基质蛋白（如纤连蛋白），用无菌PBS或包被缓冲液稀释至工作浓度（例如，纤连蛋白常用5-10 µg/mL）。
    • 向96孔板的各实验孔中加入适量基质溶液（通常每孔50-100 µL）。
    • 将孔板置于4˚C冰箱过夜（至少2小时）或37˚C孵育1-2小时，使基质蛋白充分吸附到孔底。
    • 吸弃包被液。
    • 每孔加入200-300 µL含有0.5-2%牛血清白蛋白（BSA）或细胞培养基的PBS溶液（封闭液），室温封闭30-60分钟。此步骤旨在封闭孔板上未被基质蛋白占据的位点，减少非特异性细胞粘附。
    • 吸弃封闭液。
    • 每孔用无菌PBS轻柔漂洗2-3次（每次加入100-200 µL PBS，轻摇后吸弃）。最后一次漂洗后吸净孔内液体（避免残留液体稀释细胞悬液），但注意孔底不要完全干燥。至此，包被好的板即可用于实验或暂时储存于4˚C（PBS湿润环境，避免干燥）。

  3. 细胞接种与粘附：

    • 将准备好的单细胞悬液轻柔混匀。
    • 向包被好的96孔板的各测试孔中加入等体积的细胞悬液（例如每孔100 µL）。注意设置：
      • 基质对照组： 细胞接种在包被基质蛋白的孔。
      • 空白对照组： 细胞接种在未包被基质蛋白（仅用BSA封闭过）的孔（评估非特异性粘附）。
      • 实验组： 细胞接种在包被基质蛋白的孔，并在悬液中添加待研究的化合物、抗体、抑制剂等。
      • 背景组： 不接种细胞的孔（仅加培养基或缓冲液），用于扣除背景信号（尤其MTT和荧光法）。
    • 将接种好的96孔板轻摇几次使细胞分布均匀。
    • 将孔板小心放入37˚C, 5% CO₂饱和湿度的培养箱中孵育特定的粘附时间（通常在30分钟至2小时之间，需根据具体细胞类型和实验目的进行预实验优化）。
    • 在孵育期间避免移动或振动孔板。

  4. 移除未粘附细胞：

    • 孵育时间结束后，取出孔板。
    • 轻柔吸弃孔内培养基及悬浮的细胞（避免直接冲击孔底已粘附的细胞）。
    • 每孔极其轻柔地沿孔壁缓慢加入预温（37˚C）的PBS或其他清洗缓冲液（约200 µL）。避免高速注入或直接冲击孔底。
    • 轻轻晃动孔板数秒（或置于摇床低速晃动）。
    • 轻柔吸弃清洗液。根据粘附牢固程度，此清洗步骤通常重复2-4次。每次清洗后可在显微镜下观察残留的非粘附细胞是否已被清除干净。

  5. 粘附细胞定量：

    • 方法选择：
      • A. 结晶紫染色法 (定量粘附细胞)：
        1. 清洗完毕后，每孔加入100-200 µL 4%多聚甲醛溶液，室温固定粘附细胞15-30分钟。
        2. 吸弃固定液，用PBS轻柔漂洗孔板3次以去除残留固定液。
        3. 吸净孔内液体。
        4. 每孔加入适量结晶紫染色液（如50-100 µL），室温避光染色10-30分钟（时间需优化）。
        5. 吸弃染色液，用流动的蒸馏水或去离子水彻底冲洗孔板，直至流出的水无色（去除未结合的染料）。
        6. 翻转孔板在吸水纸上拍干。
        7. 每孔加入适量的溶解液（如1% SDS或10%醋酸，100-200 µL），室温放置10-30分钟（或在摇床上低速震荡加速溶解）。
        8. 充分混匀孔内液体。
        9. 使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度值（OD570）。
      • B. MTT比色法 (定量活细胞)：
        1. 清洗完毕后，吸净孔内残留的PBS。
        2. 在各孔（包括背景组孔）中加入含MTT的无血清培养基（或PBS）溶液（如100 µL/孔，MTT终浓度0.5 mg/mL）。
        3. 将孔板放回培养箱中继续孵育1-4小时（通常37˚C, 5% CO₂）。
        4. 小心吸弃孔内含MTT的培养液。
        5. 每孔加入适量溶解液（如DMSO, 100-150 µL/孔），在摇床上低速震荡10-30分钟，使紫色甲臜结晶充分溶解。
        6. 使用酶标仪在570nm（检测波长）参考630nm或690nm（参考波长）测定各孔的吸光度值（OD570）。
      • C. 荧光染料法 (定量活细胞/总细胞)：
        1. 清洗完毕后，吸净孔内残留的PBS。
        2. 直接向各孔中加入含荧光染料（如Calcein AM）的缓冲液（通常为不含酚红的Hanks平衡盐溶液或PBS）。Calcein AM工作浓度需预实验确定（如1-10 µM）。
        3. 将孔板放回培养箱中避光孵育30-60分钟（37˚C）。
        4. 孵育结束后，可直接在荧光酶标仪上读取各孔的荧光强度（Ex 485-495 nm / Em 515-535 nm）。若背景高，也可用PBS轻柔清洗一次后再检测（需验证清洗是否导致荧光损失）。
        5. 注意： 若需标记接种的总细胞量以计算粘附比例，可提前用染料标记细胞悬液中的一部分细胞，取等量接种于另一个单独的孔板（不经清洗步骤）。孵育相同时间后，直接裂解细胞或加入染料激活剂，测定该孔荧光强度作为总细胞量的参考。

四、 数据处理与分析

  1. 计算粘附率：

    • 对于单一基质组：
      • 粘附率 (%) = (实验组信号值 – 背景组信号值) / (基质对照组信号值 – 背景组信号值) × 100%
    • 比较不同条件：
      • 粘附细胞相对值 = (实验组信号值 – 背景组信号值) / (基质对照组信号值 – 背景组信号值) （通常基质对照组设为100%或1.0）
      • 粘附细胞绝对数量（若细胞计数标准曲线已建立）。

  2. 扣除背景： 所有实验组和对照组的信号值均需减去背景组的信号值（仅含溶解液或染料的孔）。

  3. 统计分析：

    • 实验至少独立重复3次（生物学重复），每次实验设置技术重复（如每个条件3个复孔）。
    • 计算每组数据的平均值±标准差（Mean ± SD）。
    • 使用适当的统计学方法（如t检验、单因素方差分析ANOVA）比较不同实验组间粘附率或相对粘附值的差异，显著性水平通常设为p < 0.05。

五、 关键注意事项

  1. 细胞状态： 使用活力高、处于对数生长期的细胞至关重要。传代次数过多或状态不佳会影响粘附能力。
  2. 胰酶消化： 消化过度会损伤细胞表面粘附分子。选择温和的消化条件（如含低浓度EDTA的胰酶），严格控制消化时间，并用血清充分中和。重悬后让细胞在无血清培养基中恢复一段时间（如15-30分钟，37˚C）再进行实验，有助于表面分子的恢复。
  3. 血清： 血清含有多种粘附蛋白（如玻连蛋白）。接种前细胞悬液和粘附孵育过程通常使用不含血清的培养基或缓冲液，以避免血清中粘附因子的干扰而产生非特异性粘附或影响待测分子的作用。封闭液和清洗液也应不含血清。
  4. 基质包被： 基质浓度、包被时间（温度）和封闭步骤需优化并保持一致。确保基质蛋白均匀覆盖孔底。
  5. 细胞接种密度： 密度过高可能导致细胞聚集或接触抑制；密度过低则信号弱、误差大。需预实验确定合适的接种密度（保证粘附后仍有足够数量的细胞供检测，且在所选检测方法的线性范围内）。
  6. 粘附时间： 时间过短，粘附不完全；时间过长，细胞可能开始铺展或迁移，影响对初始粘附能力的准确评估。根据细胞类型严格优化和控制时间。
  7. 清洗力度： 这是实验成败的关键环节。清洗力度过大（如水流猛烈冲击、震荡剧烈）会洗掉已粘附的细胞；力度过小则无法去除未粘附细胞，导致假阳性。务必保持所有批次清洗操作的一致性和轻柔度。清洗缓冲液最好预温至37˚C。
  8. 孔板均匀性： 注意96孔板边缘孔（蒸发效应）和中心孔的差异。可将实验组随机分布在孔板不同位置，或使用边缘孔盛放PBS保持湿度。
  9. 标准化： 所有操作步骤，特别是孵育时间和温度、清洗次数和方式、染色/溶解时间等，应在所有实验组和重复间保持一致。
  10. 对照设置： 空白对照（无基质包被）用于评估非特异性粘附；背景组（无细胞）用于扣除试剂背景；基质对照组（无处理）是计算粘附率的基准。实验组应包含适当的阳性和阴性对照。
  11. 无菌操作： 虽然粘附时间短，但在整个细胞悬液制备、基质包被（封闭后可短暂置于超净台紫外灭菌）及接种过程中仍需保持无菌操作习惯，避免污染影响后续可能的细胞培养分析。
  12. 清洁度： 保证所有接触细胞的器皿（离心管、吸头、孔板）清洁无尘无杂质，以免影响粘附或产生背景信号。

结论

体外细胞粘附实验是研究细胞与基质相互作用机制、筛选影响粘附的分子（如药物、抗体、siRNA）或评估细胞粘附特性变化的经典工具。严格遵守标准化操作规程，精心优化关键参数（细胞状态、基质包被、粘附时间、清洗力度），并设置严格的对照，是获得可靠、可重复结果的基石。数据分析时需结合生物学重复和统计学方法，才能得出科学的结论。谨记实验中的每一个细节都可能影响最终结果，操作务必一丝不苟。