活性氧生成试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：21 作者：生物检测中心

活性氧生成试验：原理、方法与应用

一、 引言

活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是生物体内氧代谢过程中产生的一类具有高度反应活性的含氧物质的总称，主要包括超氧阴离子（•O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（•OH）、单线态氧（¹O₂）等。在生理状态下，ROS作为重要的信号分子参与细胞增殖、分化、免疫反应等多种生命过程。然而，当细胞受到外界刺激（如紫外辐射、化学毒物、病原体感染）或内部代谢紊乱时，ROS的产生会异常增加，超过机体抗氧化系统的清除能力，导致氧化应激（Oxidative Stress）。持续的氧化应激会攻击生物大分子（如DNA、蛋白质、脂质），造成结构损伤和功能丧失，与衰老以及多种疾病（如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病及其并发症）的发生发展密切相关。

因此，精确、可靠地检测细胞内或特定体系中ROS的水平及其动力学变化，对于阐明氧化还原信号传导机制、评估环境胁迫或药物毒性、筛选抗氧化剂以及研究相关疾病的病理过程至关重要。活性氧生成试验（ROS Assay）正是为此目的而发展的一系列检测技术的统称。

二、 常见活性氧生成检测方法原理与技术

由于ROS种类繁多、化学性质活泼且寿命普遍较短（如•OH仅存续约10⁻⁹秒），直接检测具有挑战性。目前主流的检测方法主要通过利用ROS的氧化还原特性与特定探针分子发生反应，产生可被仪器检测的信号变化（如荧光、化学发光、颜色变化）来间接反映其水平。以下介绍几种常用且成熟的技术：

  1. 荧光探针法：

    • 原理： 利用对特定ROS具有选择性响应的荧光探针分子。这些探针本身荧光较弱或无荧光，被目标ROS氧化后，其结构发生改变，产生强荧光信号或改变荧光特性（波长、强度）。
    • 常用探针：
      • 二氢乙啶（Dihydroethidium, DHE） / 羟乙基哌嗪乙磺酸乙锭（Hydroethidine, HE）： 最常用于检测超氧阴离子（•O₂⁻）。DHE本身呈蓝色荧光，被•O₂⁻氧化后形成具有红色荧光（激发/发射波长约为~518/605 nm）的羟基乙锭（2-hydroxyethidium），该产物对•O₂⁻特异性较高。也可进一步氧化为与DNA结合的乙锭（Ethidium），发射橙红色荧光（~518/605 nm），但特异性较低。
      • 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H₂DCFDA / DCFH-DA）： 应用最广泛的通用型ROS探针。探针本身无荧光，可自由穿透细胞膜进入胞内，被细胞内酯酶水解为H₂DCF（2',7'-Dichlorodihydrofluorescein）。H₂DCF随后被H₂O₂、•OH、过氧亚硝基阴离子（ONOO⁻）等氧化为具有绿色荧光（激发/发射波长约为~485/525 nm）的DCF（2',7'-Dichlorofluorescein）。该探针灵敏度高，但对ROS种类特异性不强。
      • 二氢罗丹明123（Dihydrorhodamine 123, DHR123）： 也是一种通用型ROS探针，原理与H₂DCFDA类似。无色无荧光的DHR123被ROS（主要是H₂O₂、•OH、次氯酸HOCl、ONOO⁻）氧化后生成具有绿色荧光（激发/发射波长~507/529 nm）的罗丹明123（Rhodamine 123）。其氧化产物带正电荷，易滞留在线粒体内，常用于检测线粒体产生的ROS。
      • 特异性探针（如Amplex Red, MitoSOX）：
        • Amplex Red试剂： 在辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）存在下，特异性与H₂O₂反应产生具有红色荧光（激发/发射波长~563/587 nm）的试卤灵（Resorufin）。常用于检测细胞外或纯化酶体系中的H₂O₂。
        • MitoSOX Red： DHE的线粒体靶向衍生物，带有三苯基亚膦阳离子基团（TPP⁺），可选择性富集于带负电荷的线粒体基质中，专门用于检测线粒体来源的超氧阴离子（•O₂⁻），发射红色荧光（激发/发射波长~510/580 nm）。
    • 检测方式： 通常借助荧光显微镜（观察细胞内ROS分布）、流式细胞仪（高通量定量分析细胞群体ROS水平）或荧光酶标仪（定量检测培养上清/裂解液/纯体系的荧光强度）进行信号采集和分析。

  2. 化学发光法：

    • 原理： 利用某些化学物质（发光探针）与特定ROS反应后产生激发态中间体，当其返回基态时释放光子（化学发光）。检测到的光强与ROS浓度成正比。
    • 常用探针：
      • 鲁米诺（Luminol）及其衍生物： 通常与增强剂（如对碘苯酚）和催化剂（如HRP或辣根过氧化物酶模拟物）联用。能被H₂O₂、•OH、HOCl、ONOO⁻等多种ROS氧化，产生波长为~425 nm的蓝光。常用于检测细胞（如吞噬细胞）或酶体系（如NADPH氧化酶）产生的ROS爆发。
      • 光泽精（Lucigenin）： 曾用于检测•O₂⁻或酶促反应（如黄嘌呤氧化酶）产生的超氧阴离子。光泽精与•O₂⁻反应生成不稳定的二氧杂环丁烷中间体，分解时发射蓝绿光（~475 nm）。但因其可能参与氧化还原循环放大信号并自身产生ROS，使用受到一定限制。
      • 海萤荧光素（Cypridina luciferin analog）： 选择性检测超氧阴离子（•O₂⁻），产生更强的蓝光（~459 nm）。
    • 检测方式： 使用化学发光检测仪或具备化学发光检测模块的酶标仪测量光信号强度。

  3. 电子顺磁共振/自旋捕捉技术（Electron Paramagnetic Resonance / Spin Trapping, EPR/ST）：

    • 原理： 这是直接检测具有未成对电子（顺磁性）的短寿命自由基（如•O₂⁻, •OH）的金标准方法。通过向体系中加入“自旋捕捉剂”（如DMPO（5,5-二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物）、DEPMPO、POBN等），这些短寿命自由基被捕捉剂捕获，形成相对稳定且寿命较长的“自旋加合物”（Spin Adducts）。这些加合物具有特定的顺磁信号（EPR谱图），通过分析谱图的特征（如超精细分裂常数），可以鉴定自由基的种类并进行定量分析。
    • 特点： 提供自由基种类的直接证据，特异性高，干扰少。但仪器昂贵，操作相对复杂，灵敏度有时不及荧光法（尤其在复杂的生物体系中）。
    • 检测方式： EPR光谱仪。

  4. 其他方法：

    • 分光光度法： 利用某些物质与ROS反应后产生颜色变化的原理进行比色分析（如在540 nm检测氮蓝四唑NBT被•O₂⁻还原生成的蓝色甲臜；在560 nm检测Amplex Red被HRP催化氧化H₂O₂生成的红色试卤灵）。操作简便，但灵敏度通常低于荧光法。
    • 电化学法： 利用修饰电极（如铂电极、玻碳电极修饰纳米材料）选择性催化ROS的电化学氧化或还原，通过测量电流响应来定量ROS。具有原位、实时监测潜力，但电极稳定性、抗干扰能力和普适性仍有挑战。
    • 蛋白质/基因表达分析： 检测氧化应激相关标志物（如脂质过氧化产物丙二醛MDA、蛋白质羰基化水平）、抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPx）活性或相关基因（如Nrf2通路基因HO-1、NQO1）的表达变化。这些是氧化应激的间接指标，反映生物体应对ROS的整体状态，而非ROS的即时水平。
 

三、 典型活性氧生成试验流程（以H₂DCFDA荧光探针法检测细胞内ROS为例）

  1. 细胞准备： 将待测细胞（贴壁或悬浮）以适当密度接种于培养板（如96孔板用于酶标仪，培养皿/玻底皿用于显微镜）。在适宜条件下（如37°C, 5% CO₂）培养至所需状态（如对数生长期）。
  2. 探针装载： 移除旧培养基，用不含血清的缓冲液（如PBS或HBSS）轻柔洗涤细胞1-2次。将H₂DCFDA探针用无血清培养基或缓冲液溶解稀释至适宜工作浓度（通常1-20 μM），加入覆盖细胞。避光条件下孵育（通常20-60分钟，37°C）。避光条件至关重要。
  3. 洗涤： 移除含探针的溶液，用无血清缓冲液彻底洗涤细胞2-3次，以去除未进入细胞或未水解的探针前体（DA形式）。此步对于降低背景荧光非常重要。
  4. 处理/刺激： 加入含有待测刺激物（如氧化应激诱导剂如百草枯、H₂O₂；或待测保护性药物等）的新鲜完全培养基（或缓冲液）。同时设置对照组（如溶剂对照、阳性对照）。
  5. 孵育与信号检测：
    • 荧光显微镜： 将培养皿置于荧光显微镜下，选择合适的滤镜组（激发~488 nm/发射~525 nm），在避光条件下定时观察并采集绿色荧光图像（通常在刺激后不同时间点）。
    • 流式细胞仪： 用胰酶或其他非酶解离液将贴壁细胞消化成单细胞悬液（注意轻柔操作避免ROS变化），重悬于适量缓冲液中。立即上机检测，激发波长~488 nm，发射光检测通道通常为FL1（~530/30 nm）。分析荧光强度中位数或几何平均数。
    • 荧光酶标仪： 直接向96孔板中加入缓冲液（防止干燥），设定激发波长~485 nm，发射波长~535 nm。在各时间点读取各孔荧光强度值。
  6. 数据处理与分析： 将实验组荧光强度值与对照组（通常是未刺激组）进行比较。结果通常表示为相对荧光单位（RFU）的倍数变化（如刺激组荧光值/对照组荧光值）或相对百分比变化。图像数据可进行荧光强度定量分析（ImageJ等软件）。
 

四、 实验关键注意事项与局限性

  1. 探针选择与特异性： 每种探针均有其优势和局限性。选择探针需考虑目标ROS种类、检测灵敏度、细胞器定位需求（如线粒体特异性探针）以及对实验结果的潜在影响（如某些探针在高浓度时有光毒性或自身产生活性氧）。H₂DCFDA等通用探针虽应用广泛，但易受多种ROS氧化且可能被细胞内氧化还原酶催化的非ROS途径氧化，解读结果需谨慎。使用特异性更高的探针（如MitoSOX、Amplex Red）或结合多种探针/方法有助于确认结果。
  2. 假阳性/假阴性：
    • 假阳性： 光照诱导探针氧化（必须严格避光操作）、细胞密度过高/死亡、试剂中的氧化剂杂质、血清中酶或抗氧化剂干扰（装载和洗涤时推荐使用无血清缓冲液）。
    • 假阴性： 探针装载效率低（优化浓度和时间）、细胞内酯酶活性不足（导致探针未被充分水解）、高浓度细胞内抗氧化剂还原了氧化产物（如DCF可能被谷胱甘肽还原）。
  3. 定量与标准化： 严格控制细胞数量、探针浓度、装载时间、洗涤强度、检测时间点等变量对于定量比较至关重要。通常建议使用阳性对照（如已知浓度的外源H₂O₂）验证体系敏感性。考虑使用细胞活性染料（如PI、7-AAD）或总蛋白含量（如BCA法）对数据进行归一化处理，排除细胞数量或活性差异带来的影响。
  4. 氧化还原状态的影响： ROS探针本身参与细胞的氧化还原反应，可能干扰细胞自身正常的氧化还原平衡（即“探针效应”）。应尽量使用最低有效浓度的探针。
  5. 方法局限性： 荧光/化学发光法提供的是相对水平而非绝对浓度；无法区分不同ROS物种（除非使用特异性极强的探针）；信号强度受细胞内环境（pH、粘度、酶活性）影响。EPR虽特异性强，但灵敏度在复杂体系中可能受限且成本高。
  6. 生物相关性： 体外实验结果需谨慎外推至体内复杂的生理或病理环境。
 

五、 应用领域

活性氧生成试验广泛应用于：

  1. 基础研究： 探究生理或病理条件下（如缺氧、炎症、凋亡、自噬、代谢应激）细胞ROS产生的分子机制和信号传导通路。
  2. 药理与毒理学： 评估药物、环境污染物、纳米材料等的氧化损伤毒性机制或筛选具有抗氧化/清除ROS活性的天然产物/合成药物。
  3. 疾病研究： 阐明癌症、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）、心血管疾病（如动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤）、糖尿病并发症等病理过程中ROS的作用。
  4. 免疫学： 检测免疫细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）在吞噬作用或受体激活后产生的“呼吸爆发”（Respiratory Burst）中的ROS。
  5. 植物与环境科学： 研究植物在生物/非生物胁迫（干旱、盐碱、重金属、病原体侵染）下的氧化应激反应。
 

六、 结论

活性氧生成试验是研究氧化还原生物学不可或缺的工具箱。荧光探针法（尤其是H₂DCFDA、DHE/MitoSOX）以其操作相对简便、灵敏度高、适用性广（细胞、组织、匀浆液、纯体系）而成为最常用的主流技术。化学发光法在检测爆发性ROS产生（如免疫细胞）方面有优势。EPR技术则在直接鉴定和定量特定自由基方面具有权威性。选择合适的方法需要考虑目标ROS种类、实验体系、所需信息（定性/定量、定位/总量）以及资源条件。无论采用哪种方法，充分理解其原理、局限性和操作要点，严格进行实验设计和对照设置，谨慎解读数据，对于获得可靠、有意义的ROS检测结果至关重要。这些试验结果不断深化我们对氧化应激在生命活动及疾病中的核心作用的理解，并为开发新型干预策略提供科学依据。

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