靶向蛋白组学定量（PRM）

发布时间：2025-06-14 11:01:55 阅读量：7 作者：生物检测中心

靶向蛋白组学利器：平行反应监测（PRM）技术详解

在蛋白质组学领域，精准定量特定目标蛋白往往比大规模无差别鉴定更具实践意义。平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring, PRM）正是为满足这一需求而生的高灵敏度、高特异性靶向蛋白定量技术，已成为生物标志物验证、信号通路关键蛋白精确定量、翻译后修饰研究等任务的金标准。

一、 PRM 的技术基石与核心原理

PRM 是现代质谱技术与靶向分析理念的结晶：

  1. 靶向性设计：

    • 研究人员需预先明确目标蛋白及其特异性肽段（通常经实验或数据库优选获得）。
    • 基于这些肽段的理化性质（分子量、保留时间、碎裂特征）设计实验方案。

  2. 四极杆-静电场轨道阱质谱核心：

    • 第一步筛选 (Q1)： 第一级四极杆质量分析器 (Q1) 严格筛选出目标肽段的前体离子（母离子），有效排除背景干扰。
    • 第二步碎裂 (HCD)： 筛选出的母离子被传输至碰撞池，采用高效的高能碰撞诱导解离 (HCD) 方式碎裂，生成碎片离子。
    • 第三步全扫描 (Orbitrap)： 核心优势在此体现： 所有碎片离子被送入高分辨率、高精度的静电场轨道阱分析器进行全扫描检测。记录下所有碎片离子的精确质荷比（m/z）及其丰度（信号强度）。

  3. 数据采集模式： 仪器在目标肽段预期的液相色谱保留时间窗口内，对母离子进行“循环采集”，即不断重复“筛选-碎裂-全扫描”流程，确保获得足够的数据点用于构建高质量色谱峰。

  4. 数据解析与定量：

    • 使用专业软件（如Skyline）分析 Orbitrap 采集的全扫描二级质谱数据。
    • 特异性筛选： 软件根据目标肽段已知的、丰度高且特异的碎片离子（通常选择3-5个）进行提取。
    • 峰面积积分： 对选定的碎片离子峰在其色谱流出时间进行峰面积积分。
    • 定量计算：
      • 标记定量： 若使用同位素标记参考肽段（SIS），目标肽段峰面积与对应标记肽段峰面积的比值用于计算绝对或相对丰度。
      • 无标记定量： 直接比较目标肽段在不同样品间的碎片离子峰面积总和（或对多个碎片离子峰面积进行求和），实现相对定量。
    • 高特异性验证： 通过同时监测多个碎片离子的色谱峰形是否重叠良好且共洗脱，以及与理论碎片谱图的匹配度（如dotp值），确保定量的目标物确为预期的肽段，最大限度消除干扰。

二、 PRM 实验流程关键步骤

  1. 目标选择 & 设计： 确定研究目标（蛋白/修饰位点），筛选最优“可测量”肽段（特异性、稳定性、离子化效率）。
  2. 样品制备： 蛋白质提取、酶解（常用胰蛋白酶）、肽段除盐纯化（标准流程）。
  3. 色谱分离： 高效液相色谱（通常是nanoLC）分离肽段混合物，优化梯度以减少共洗脱干扰。
  4. 质谱分析： 在搭载轨道阱的质谱仪上运行精心优化的 PRM 方法。设定关键参数：
    • 母离子隔离窗口（Q1, 通常1-3 m/z 或 Th）
    • 碎裂能量（HCD能量，需优化）
    • 分辨率（Orbitrap分辨率，通常≥30,000 FWHM @ m/z 200或更高）
    • 最大注入时间（Max IT）
    • 自动增益控制目标值（AGC Target）
    • 循环时间（确保每个色谱峰采集足够的点）
    • 母离子列表（目标肽段及其电荷态）
  5. 数据处理与分析： 导入Skyline等软件，进行碎片离子提取、峰积分、定量计算、质量评估（峰形、共洗脱、碎片谱图匹配度）。
  6. 统计学分析 & 生物学解释： 对定量结果进行统计分析，挖掘生物学意义。

三、 PRM 的独特优势

  1. 极高的特异性与选择性： 基于母离子筛选+多碎片离子监测+高分辨率二级谱图，能有效区分同分异构体、近分子量干扰物，解决了传统SRM/MRM在复杂基质中可能遇到的干扰问题。
  2. 卓越的灵敏度： 高分辨率轨道阱检测结合优化的传输效率，使其能够在微量样品（如单针细胞、微量组织、低丰度血浆蛋白）中检测目标物。
  3. 灵活性与可回溯性： 全扫描二级谱图记录了所有碎片信息，无需预先指定监测的子离子。实验后可根据需要灵活选择最佳碎片离子进行定量，或重新分析历史数据寻找新目标碎片。
  4. 高定量准确度与精密度： 严格的质量控制流程（保留时间、碎片离子匹配、峰形）确保了结果的可靠性，尤其在临床样本验证中至关重要。
  5. 通量适中： 相较于非标/DIA的大规模发现，PRM通量较低（通常一次运行监测数十到百个目标肽段），但其“精准打击”的特性使其在目标明确的验证和精确定量任务中效率极高。

四、 核心应用场景

  1. 生物标志物验证： 将发现组学（如Label-free, DIA）筛选出的候选标志物在更大规模临床队列中进行严格验证（灵敏度和特异性是关键）。
  2. 信号通路关键节点蛋白的精确定量： 定量研究特定刺激或扰动下，通路中关键激酶、磷酸化修饰位点等的动态变化。
  3. 翻译后修饰（PTM）定量： 精准定量磷酸化、乙酰化、糖基化等修饰位点的丰度变化（需富集或针对性肽段设计）。
  4. 蛋白质复合物或相互作用研究： 定量复合物成员或互作蛋白的表达水平。
  5. 治疗性蛋白质/抗体药代动力学研究： 定量生物基质（如血浆）中的重组蛋白药物或其抗药物抗体。
  6. 标准品/参考方法的建立： 作为建立高度可靠的靶向定量检测方法的基础（常结合SIS肽段）。

五、 面临挑战与发展方向

  1. 通量限制： 同时监测的目标数量受限于色谱峰宽和质谱循环时间。解决方案：优化色谱梯度、使用FAIMS等新型离子淌度分离技术减少干扰、仪器硬件升级（更快的扫描速度）。
  2. 方法开发复杂性： 需要丰富的质谱经验进行肽段筛选、参数优化、方法建立和数据解读。自动化工具（如Skyline）正在简化流程。
  3. 标准品需求（绝对定量）： 可靠的绝对定量高度依赖合成同位素标记肽段（SIS），其成本较高且部分肽段难以合成或性质不佳。无标相对定量仍广泛应用。
  4. 数据复杂性： 高分辨率全扫描数据量大，需要强大的计算资源和先进的算法进行高效处理和质量控制。
  5. 自动化与集成化： 向更高程度的自动化方法开发、数据采集和分析流程发展，提高可重复性和实验室间一致性。
  6. 拓展应用边界： 结合新型样品前处理技术（如单细胞蛋白质组学）、更灵敏的质谱平台，挑战更低丰度、更微量样本的分析。

总结：

平行反应监测（PRM）凭借其无可匹敌的灵敏度、特异性和定量准确性，在靶向蛋白质组学领域确立了核心地位。它将传统SRM/MRM的策略优势与现代高分辨、高精度质谱仪器的强大性能完美结合，特别适用于目标明确、需要极高可靠性和准确度的生物医学研究问题，如生物标志物的严格验证和信号通路的精细剖析。随着技术的不断进步（硬件加速、软件智能化、流程自动化），PRM将在推动精准医学发展和深入理解生命过程的复杂调控网络中发挥愈加关键的作用。

参考文献（示例格式）：

  • Peterson, A. C., Russell, J. D., Bailey, D. J., Westphall, M. S., & Coon, J. J. (2012). Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Molecular & Cellular Proteomics, 11(11), 1475–1488.
  • Rauniyar, N., & Yates, J. R. (2014). Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of Proteome Research, 13(12), 5293–5309. (注：此文虽聚焦iTRAQ/TMT，但对靶向与非靶向策略对比有参考价值)
  • Gallien, S., Duriez, E., Crone, C., Kellmann, M., Moehring, T., & Domon, B. (2012). Targeted proteomic quantification on quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics, 11(12), 1709–1723.
  • MacLean, B., Tomazela, D. M., Shulman, N., ... & MacCoss, M. J. (2010). Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics, 26(7), 966–968.