MTT细胞活力试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：8 作者：生物检测中心

MTT细胞活力试验：原理、步骤与应用

摘要： MTT细胞活力试验是一种广泛应用于评估细胞代谢活性和增殖状态的比色测定方法。该方法基于活细胞线粒体酶将黄色水溶性MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）还原为不溶于水的紫色甲臜结晶的能力。甲臜结晶溶解后，可通过分光光度法测定其吸光度，从而量化活细胞的相对数量。本文详细阐述了MTT试验的原理、所需材料、操作步骤、数据分析、优缺点及其在生物医学研究中的应用。

一、 原理

MTT是一种四氮唑盐，可穿透活细胞的细胞膜进入细胞质。在活细胞中，线粒体琥珀酸脱氢酶等还原型辅酶（NADH和NADPH）依赖的脱氢酶能将MTT还原，生成不溶于水的蓝紫色甲臜（Formazan）结晶。甲臜结晶主要沉积在细胞质内，有时也可能在细胞周围形成。结晶的数量与活细胞的数量及其线粒体酶的活性（通常与细胞代谢活力成正比）直接相关。死细胞或活力受损的细胞则失去或显著降低这种还原能力。通过溶解甲臜结晶，并在特定波长（通常在490-570nm范围内）测量其吸光度，即可间接反映培养体系中活细胞的相对数量和活力状态。

二、 材料与试剂

  1. 细胞： 待测细胞系或原代细胞。
  2. 培养基： 细胞生长所需的标准培养基（如DMEM, RPMI-1640等），通常不含酚红以减少背景干扰。
  3. MTT溶液： 通常用磷酸盐缓冲液（PBS）或无酚红培养基配制。常用浓度为5 mg/mL，过滤除菌后避光保存于4°C（短期）或-20°C（长期）。使用前恢复至室温并避光。
  4. 溶解液： 用于溶解甲臜结晶。常用溶解液包括：
    • 二甲基亚砜（DMSO）： 最常用，溶解能力强。
    • 酸化异丙醇： 在异丙醇中加入少量盐酸（如0.04 M HCl）。
    • 含SDS的缓冲液： 如含10% SDS的缓冲液。
    • 选择溶解液需考虑其溶解效率、背景吸光度和后续检测的兼容性。
  5. 缓冲液： 磷酸盐缓冲液（PBS），用于洗涤细胞。
  6. 耗材： 96孔平底细胞培养板、多通道移液器及吸头、细胞培养箱、酶标仪（配备570nm滤光片或检测波长，参考波长可选630nm或650nm）、离心机（若需离心步骤）、生物安全柜、计时器。
 

三、 实验步骤

  1. 细胞铺板与处理：

    • 将处于对数生长期的细胞消化、计数，用完全培养基重悬至所需密度。
    • 将细胞悬液均匀接种到96孔板中，每孔通常加入100 μL（具体体积根据实验设计调整）。边缘孔容易因蒸发导致误差，建议用PBS或无细胞培养基填充边缘孔作为空白对照。
    • 将培养板放入37°C、5% CO2培养箱中培养过夜（约12-24小时），使细胞贴壁并恢复。
    • 根据实验设计，向各孔加入不同浓度的待测药物、处理因子或对照（如阳性对照细胞毒药物，阴性对照仅培养基）。每个浓度或条件建议设置3-6个复孔。
    • 将培养板继续放回培养箱中孵育设定的处理时间（如24、48、72小时）。

  2. 加入MTT溶液：

    • 孵育结束后，小心吸弃或弃去孔板中各孔的培养基（避免扰动贴壁细胞）。对于悬浮细胞，需先低速离心（如1000 rpm, 5分钟）后再小心吸弃上清。
    • 向每孔中加入新鲜配制的MTT溶液（通常每孔加入100 μL含0.5 mg MTT的溶液，即5 mg/mL溶液100 μL）。
    • 将培养板放回37°C、5% CO2培养箱中避光孵育2-4小时（具体时间需根据细胞类型和密度优化，以形成足够量甲臜结晶但不过度孵育为宜）。孵育期间避免晃动培养板。

  3. 溶解甲臜结晶：

    • 孵育结束后，小心吸弃孔内的MTT溶液（对于贴壁细胞，动作要轻柔）。
    • 向每孔中加入预定体积（如100-150 μL）的溶解液（如DMSO）。
    • 将培养板置于水平摇床上，低速避光振荡10-15分钟，或静置避光放置一段时间（如15-30分钟），确保所有紫色甲臜结晶完全溶解，溶液呈均匀的紫色。

  4. 吸光度测定：

    • 使用酶标仪，在570 nm波长处测量各孔的吸光度（OD570）。为了减少因溶解液自身、孔板或液体中的气泡、杂质等引起的非特异性吸光度干扰，通常选择一个较高波长（如630 nm或650 nm）作为参考波长进行扣除。
    • 记录所有孔的OD570值（扣除参考波长背景后的值）。
 

四、 数据分析

  1. 计算平均值： 计算各处理组复孔的OD570平均值。
  2. 计算细胞活力： 细胞活力通常以相对于未处理对照组（阴性对照）的百分比表示：
    • 细胞活力 (%) = (处理组平均OD570 / 阴性对照组平均OD570) × 100%
    • 若存在背景（仅含培养基和MTT/溶解液，无细胞），则：
      细胞活力 (%) = [(处理组平均OD570 - 空白孔平均OD570) / (阴性对照组平均OD570 - 空白孔平均OD570)] × 100%
  3. 绘制曲线： 以处理因子（如药物浓度）为横坐标（X轴），细胞活力百分比为纵坐标（Y轴），绘制剂量-效应曲线。通常使用合适的软件（如GraphPad Prism）进行非线性回归分析，计算半抑制浓度（IC50）等参数。
  4. 统计分析： 采用适当的统计方法（如t检验、方差分析ANOVA）比较不同处理组间细胞活力的统计学差异。
 

五、 优点与局限性

  • 优点：
    • 操作相对简单快速： 步骤标准化，易于掌握。
    • 灵敏度较高： 适用于多种贴壁和悬浮细胞。
    • 成本较低： 主要试剂价格相对便宜。
    • 高通量潜力： 96孔板形式便于进行大规模药物筛选或条件优化。
    • 无需放射性标记： 安全性好。
  • 局限性：
    • 非直接细胞计数： 反映的是细胞代谢活力（线粒体脱氢酶活性）而非绝对细胞数量。细胞数量变化和线粒体活性变化都可能影响结果。
    • 甲臜结晶形成受干扰： 某些处理因素（如强还原剂、氧化剂）或培养基成分（如高浓度血清、某些抗氧化剂）可能直接影响MTT的还原过程，导致假阳性或假阴性结果。
    • 溶解步骤影响： 溶解效率、溶解液的均一性以及溶解后放置时间过长可能影响吸光度读数的准确性。
    • 不能区分细胞类型： 在混合细胞培养中，无法区分不同细胞亚群的活力。
    • 终点法： 通常为单时间点检测，不能实时监测细胞活力动态变化。
    • 甲臜结晶溶解问题： 有时结晶溶解不完全或形成沉淀，影响读数。
 

六、 应用领域

MTT试验因其简便性和经济性，在生物医学研究的多个领域广泛应用：

  1. 药物筛选： 评估候选化合物、天然产物、合成药物对肿瘤细胞、病原体（如细菌、寄生虫）或特定细胞类型的细胞毒性或抑制增殖作用，计算IC50。
  2. 细胞毒性研究： 检测环境毒素、重金属、纳米材料、辐射等对细胞的毒性效应。
  3. 细胞增殖研究： 评估生长因子、激素、细胞因子等对细胞增殖的刺激或抑制作用。
  4. 免疫学研究： 检测淋巴细胞对丝裂原或抗原的增殖反应。
  5. 生物材料相容性评价： 评估植入材料或其浸提液对细胞的毒性。
  6. 营养与代谢研究： 研究营养物质或代谢物对细胞活力的影响。
 

七、 关键注意事项

  1. 细胞状态： 使用状态良好、处于对数生长期的细胞，接种密度需优化（避免过密或过稀影响结果线性范围和灵敏度）。
  2. 无菌操作： 在生物安全柜内进行无菌操作。
  3. MTT溶液： 现配现用或使用近期配制的溶液，避免反复冻融。加入MTT溶液时避免产生气泡。孵育过程严格避光。
  4. 孵育时间： MTT孵育时间需根据细胞类型和密度进行预实验优化。时间过短，甲臜产量不足；时间过长，可能导致细胞死亡或甲臜结晶分解。
  5. 溶解液选择与操作： 选择溶解效率高、背景低的溶解液。加入溶解液后需确保结晶完全溶解，振荡或静置时间一致。溶解后应尽快读数（如1小时内），避免甲臜降解或溶剂挥发影响结果。DMSO有毒性，操作时注意防护。
  6. 边缘效应： 96孔板边缘孔因蒸发快、温度不均，结果可能不稳定，建议避免使用或仅用作空白对照。
  7. 设对照： 必须设置无细胞空白孔（仅含培养基、MTT和溶解液）和未处理细胞对照孔（阴性对照）。必要时设置阳性对照孔（如加入已知细胞毒药物）。
  8. 酶标仪校准： 确保酶标仪工作正常，比色杯或孔板底部清洁无划痕。
  9. 结果解读： 结合其他检测方法（如台盼蓝染色计数、流式细胞术分析细胞周期/凋亡、LDH释放试验等）综合判断细胞状态，避免单一MTT结果的误导。
 

结论

MTT细胞活力试验是一种成熟、可靠且应用广泛的体外细胞活性检测方法。理解其原理、熟练掌握操作步骤并注意关键影响因素，对于获得准确、可重复的实验结果至关重要。尽管存在一些局限性，但其简便、经济、高通量的特点使其在基础研究、药物开发和毒性评价中仍占据重要地位。研究人员应结合具体实验目的和细胞类型，严谨设计实验，并合理解读数据。

参考文献：

  1. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, 65(1-2), 55–63.
  2. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., & Cloos, J. (2011). Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 731, 237–245.
  3. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., & Villanueva, Á. (2012). MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica, 114(8), 785–796. (Note: This highlights an important consideration regarding formazan localization).
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