蛋白互作组学（co-IP-MS） - 中析研究所生物检测中心

蛋白互作组学：基于免疫共沉淀-质谱联用 (co-IP-MS) 的技术解析与应用

摘要： 免疫共沉淀-质谱联用 (Co-Immunoprecipitation coupled with Mass Spectrometry, co-IP-MS) 是研究细胞内蛋白质相互作用的强大技术。它结合了免疫沉淀的特异性与质谱的高通量和灵敏度，能系统鉴定目标蛋白（“诱饵蛋白”）的直接和间接相互作用伴侣，构建蛋白互作网络。本文详述co-IP-MS的技术原理、实验流程、数据分析、应用领域及其优势与挑战。

一、技术原理

免疫共沉淀 (Co-Immunoprecipitation, co-IP)：
- 利用针对特定目标蛋白（诱饵蛋白）的高特异性、高亲和力抗体。
- 在接近生理条件下（使用非变性裂解液）裂解细胞或组织样本，尽可能保持天然蛋白质复合物的结构和完整性。
- 将抗体加入细胞裂解液中，抗体与诱饵蛋白特异性结合。
- 加入预先耦联了蛋白A/G的固相载体（如琼脂糖珠、磁珠），抗体Fc段与载体上的蛋白A/G结合，从而将“抗体-诱饵蛋白”复合物及其紧密结合的相互作用蛋白（“猎物蛋白”） 一同捕获并沉淀下来。
- 通过多次洗涤去除未结合的非特异性蛋白。
- 最终得到富集了诱饵蛋白及其相互作用蛋白的复合物。
质谱分析 (Mass Spectrometry, MS)：
- 将免疫共沉淀得到的蛋白复合物进行变性处理（通常加热并加入还原剂和烷基化试剂），破坏蛋白质间非共价结合。
- 使用特定的蛋白酶（如胰蛋白酶）将蛋白质消化成肽段混合物。
- 利用液相色谱 (LC)，通常是反相色谱，对复杂肽段混合物进行分离，降低复杂性。
- 分离后的肽段进入质谱仪（通常是高分辨串联质谱仪）。
- 质谱仪首先测量肽段母离子的质荷比 (MS1)。
- 然后选择特定母离子进行碎裂（碰撞诱导解离CID或更高能碰撞解离HCD等），产生子离子图谱 (MS2)。
- 将获得的MS2图谱与相应物种的蛋白质数据库进行比对搜索，鉴定出肽段对应的原始蛋白质。

二、实验流程

样本准备：
- 细胞培养/组织获取： 培养目标细胞系或获取新鲜/冷冻组织。
- 裂解： 使用非变性裂解缓冲液（通常含去垢剂、盐、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等）裂解细胞/组织。关键点在于保持蛋白复合物完整性。
- 离心澄清： 高速离心去除不溶性物质，得到澄清的细胞总蛋白裂解液。
预清除：
- 目的：降低非特异性结合背景。将裂解液与未耦联抗体的载体孵育，吸附掉易与载体发生非特异性结合的蛋白。
- 移走上清液用于后续免疫沉淀。
免疫沉淀：
- 将特异性抗体加入预清除后的裂解液中，在4°C下温和旋转孵育足够时间（通常1-4小时或过夜），形成抗体-诱饵蛋白复合物。
- 加入预处理（如用裂解液平衡过）的蛋白A/G载体，继续孵育（通常1-2小时），使抗体-诱饵蛋白复合物结合到载体上。
- 设置严格的阴性对照至关重要：
  - 同型对照 (IgG Control)： 使用与目标抗体同种属、同亚型的非特异性免疫球蛋白进行免疫沉淀。
  - 空白载体对照 (Beads Only Control)： 仅使用不含抗体的载体进行免疫沉淀。
  - 靶标敲除/敲低样本： 如果可行，使用诱饵蛋白缺失或显著降低表达的细胞系作为对照。
洗涤：
- 通过多次离心或磁力分离，移除上清液。
- 用预冷、成分经过优化的洗涤缓冲液（通常具有一定离子强度和非离子去垢剂）反复洗涤沉淀（通常4-6次），彻底去除未结合和非特异性结合的污染物。洗涤缓冲液的严格程度（离子强度、去垢剂浓度）需要优化，以平衡特异性和互作复合物的稳定性。
洗脱：
- 将沉淀物重悬于低pH洗脱缓冲液（如含甘氨酸）或含有还原剂的SDS-PAGE上样缓冲液中，使蛋白复合物从载体上解离下来。
- 离心或磁力分离，收集含有目标蛋白复合物的上清液。
样品制备（质谱前处理）：
- 还原：加入还原剂（如二硫苏糖醇DTT）断开二硫键。
- 烷基化：加入烷基化试剂（如碘乙酰胺IAM）封闭游离巯基，防止重新形成二硫键。
- 酶解：加入胰蛋白酶（或其类似物Trypsin/Lys-C混合酶）在适宜温度（通常37°C）下孵育过夜或数小时，将蛋白质切割成肽段。
- 酸化：加入甲酸终止酶解反应。
- 除盐/脱盐： 使用C18固相萃取小柱去除样品中的盐、去垢剂、缓冲液离子等干扰质谱分析的杂质，并将肽段浓缩于适合质谱进样的溶剂（通常为含乙腈和甲酸的水溶液）中。
- 干燥/复溶：真空离心干燥肽段样品，并用质谱进样缓冲液复溶。
液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 分析：
- 利用纳流或微流液相色谱系统将肽段混合物进行高效分离。
- 分离后的肽段依次进入高分辨串联质谱仪（如轨道阱类质谱仪）。
- 质谱仪进行数据依赖采集 (DDA) 或数据非依赖采集 (DIA) 模式扫描：
  - DDA模式： 在MS1扫描中检测到强度最高的前N个肽段离子，依次对其进行MS2碎裂扫描。
  - DIA模式： 将MS1质谱窗口分成多个连续的小窗口，对每个窗口内的所有离子进行无差别的碎裂和MS2扫描。

三、数据分析

数据库搜索：
- 将获得的原始质谱数据文件导入蛋白质组学分析软件。
- 使用搜索引擎（如MaxQuant、Proteome Discoverer内置的Sequest HT/Mascot等）将MS2图谱与选定的目标物种蛋白质数据库进行比对匹配。
- 设定搜索参数：蛋白酶种类（胰蛋白酶）、允许漏切位点数、固定修饰（如半胱氨酸烷基化）、可变修饰（如甲硫氨酸氧化、丝/苏/酪氨酸磷酸化）、肽段和蛋白质错误发现率 (FDR) 阈值（通常≤1%）。
蛋白质鉴定与定量（若进行定量研究）：
- 根据匹配的肽段信息鉴定蛋白质。
- 如需定量（如比较不同处理组或对照），可通过：
  - 标记定量 (Label-based)： 如TMT、SILAC。基于报告离子或轻/重同位素肽段的强度比值进行定量。
  - 无标记定量 (Label-free quantitation, LFQ)： 基于肽段母离子在LC-MS中的色谱峰强度或谱图计数进行相对定量。
互作蛋白筛选：
- 核心步骤是区分真实的互作蛋白与非特异性污染物。主要策略：
  - 对照减法： 将实验组（诱饵IP）鉴定到的蛋白列表与阴性对照组（如IgG IP或空白载体IP）鉴定到的蛋白列表进行比较。剔除非特异性结合蛋白（通常在对照组中也高丰度出现）。
  - 显著性分析： 使用专门的互作组分析工具（如SAINT、ComPASS、MiST）：
    - 基于质谱谱图数或强度值。
    - 结合生物学重复（强烈建议≥3次独立重复）。
    - 计算每个候选猎物蛋白在实验组相较于对照组的富集程度和统计显著性 (p值或FDR)。
    - 设定严格的阈值（如SAINT概率≥0.9，FDR<5%）筛选高置信度互作蛋白。
  - 数据库比对： 将候选互作蛋白与已知的蛋白互作公共数据库（如BioGRID、STRING、IntAct）进行比对，寻找已知互作的支持证据，增加可信度。
  - 生物信息学注释： 对筛选出的高置信度互作蛋白进行功能注释（GO富集分析、KEGG Pathway分析等），揭示诱饵蛋白可能参与的生物学过程和通路。

四、应用领域

构建蛋白互作网络： 大规模鉴定特定蛋白在特定条件下的相互作用网络，理解其在信号通路、复合体中的作用。
发现新的相互作用伴侣： 鉴定与已知蛋白（如疾病相关蛋白、转录因子、激酶、受体）相互作用的未知蛋白。
复合物组成解析： 确定特定蛋白复合物（如转录调节复合物、剪接体、核孔复合物）的完整或核心组分及其动态变化。
研究互作动态性： 结合刺激（如药物处理、生长因子刺激）或时间梯度取样，研究蛋白质互作在信号传导、细胞周期、应激响应过程中的动态变化。
疾病机制研究： 鉴定疾病相关蛋白（如致癌蛋白、抑癌蛋白、神经退行性疾病相关蛋白）的异常互作网络，揭示发病机理和寻找潜在治疗靶点（例如在癌症中鉴定致癌转录因子的新型共激活因子；在神经退行性疾病中研究致病蛋白的异常聚集伙伴）。
药物靶点验证： 研究小分子药物或生物制剂对特定蛋白与其相互作用伴侣结合的影响，验证药物作用机制和特异性。
翻译后修饰 (PTM) 依赖的互作研究： 通过优化裂解和洗涤条件，分析特定翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）如何调控蛋白质相互作用（常结合PTM特异性抗体或修饰组学）。

五、优势与挑战

优势：
- 体内接近生理状态： 在接近天然的细胞环境中捕获互作，能反映真实的生物学状态。
- 高通量： 质谱可一次性鉴定出数十至数百个相互作用蛋白。
- 灵敏度高： 现代高灵敏质谱仪可检测低丰度相互作用蛋白。
- 无偏向性： 理论上可以鉴定所有与诱饵蛋白相互作用的蛋白，不需要预设目标蛋白。
- 可发现间接互作： 能捕获大型复合体中的间接相互作用伴侣。
- 结合定量分析： 可比较不同条件下的互作强度变化。
挑战与局限性：
- 抗体依赖性： 实验结果高度依赖抗体的特异性、亲和力和效价。抗体质量不佳会导致假阳性或假阴性。某些蛋白缺乏高质量抗体。
- 非特异性结合： 即使设置严格对照，仍存在背景噪声。需要精细优化洗涤条件并进行严格生物信息学筛选。
- 假阳性： 可能包含在裂解或IP过程中非特异结合或共沉淀的非生理性互作。
- 假阴性： 低丰度、弱亲和力、瞬时、空间受阻或依赖于特定细胞状态/亚定位的互作可能被漏检。
- 间接互作： 无法区分直接互作和间接互作（猎物蛋白通过中间蛋白与诱饵相连）。
- 动态范围限制： 高丰度蛋白可能掩盖低丰度但有生物学意义的互作蛋白。
- 样本处理影响： 裂解缓冲液的成分和强度可能破坏某些脆弱的互作。
- 复杂性： 实验流程长、步骤多、技术门槛高（尤其是质谱部分），需要专业的实验技能和生物信息学分析能力。
- 成本高昂： 高质量抗体、质谱机时和数据分析均涉及较高费用。
- 需要独立验证： 鉴定出的互作蛋白通常需要用其他独立的生物学方法（如Western blotting验证、荧光共定位、哺乳动物双杂交、FRET/BRET、BiFC、pull-down、交联质谱）进行验证。

六、技术展望

co-IP-MS技术仍在不断发展中：

更高通量与自动化： 自动化样本处理平台和更快速的质谱扫描方法提高通量。
更高灵敏度和深度： 新型质谱仪、预分级技术和新的样品制备方法（如SISPROT）提高低丰度蛋白检测能力。
更精准的定量： 改进的标记和无标记定量策略，结合DIA采集模式，提高定量的准确性和重复性。
原位或近位标记技术： 如BioID（生物素连接酶介导邻近标记）和APEX（抗坏血酸过氧化物酶介导邻近标记）技术与质谱联用，可在活细胞内标记诱饵蛋白邻近的蛋白（包括弱互作、瞬时互作和空间邻近蛋白），作为co-IP的重要补充。
整合结构信息： 结合交联质谱 (XL-MS) 获取互作界面信息，或整合冷冻电镜数据解析复合物结构。
单细胞/微量样本分析： 开发适用于单细胞或微量组织样本的co-IP-MS方法。
空间分辨率： 结合显微切割或成像质谱技术，探索蛋白质互作在特定亚细胞区域或组织结构中的空间特异性。
人工智能辅助分析： AI用于优化实验设计、提升质谱数据分析效率、预测互作及功能、降低假阳性率。

结语

Co-IP-MS作为蛋白互作组学研究的核心支柱技术，因其能在接近生理状态下高通量、系统性地解析蛋白质相互作用网络而具有不可替代的价值。尽管存在抗体依赖性、背景噪声、假阳性/阴性等挑战，但通过严格实验设计（包括关键对照）、持续的技术优化（样品处理、质谱平台、数据采集模式）以及先进生物信息学分析策略的应用，其结果的可靠性和深度在不断提升。它在基础机理探索（如信号通路、复合物组装）、疾病机制阐明（癌症、神经疾病、感染）和药物靶点发现与验证等领域持续发挥着关键作用。随着邻近标记技术、交联质谱、人工智能等新方法的融合，co-IP-MS将在绘制更精确、更动态、更具空间分辨率的蛋白质互作图谱中展现更强大的潜力。

参考文献 (此处列出通用性综述或经典方法学论文，省略企业相关引用)

Dunham, W. H., Mullin, M., & Gingras, A. C. (2012). Affinity-purification coupled to mass spectrometry: Basic principles and strategies. Proteomics, 12(10), 1576-1590.
Liu, X., Salokas, K., Weldatsadik, R. G., Gawriyski, L., & Varjosalo, M. (2023). Combined proximity labeling and affinity purification−mass spectrometry workflow for mapping and visualizing protein interaction networks. Nature Protocols, 18(1), 18-37.
Mellacheruvu, D., ... & Nesvizhskii, A. I. (2013). The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification–mass spectrometry data. Nature methods, 10(8), 730-736.
Trinkle-Mulcahy, L. (2019). Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Research, 8.
Choi, M., ... & Nesvizhskii, A. I. (2011). SAINT: probabilistic scoring of affinity purification–mass spectrometry data. Nature methods, 8(1), 70-73.
Hein, M. Y., ... & Mann, M. (2015). A human interactome in three quantitative dimensions organized by stoichiometries and abundances. Cell, 163(3), 712-723.