荧光原位杂交技术（FISH）详解
荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization, FISH）是一项强大的分子细胞遗传学技术，它利用荧光标记的核酸探针，直接在细胞、组织或染色体标本上定位和可视化特定核酸序列（DNA或RNA）的空间位置和相对丰度。
一、 技术原理
FISH的核心原理基于核酸碱基互补配对原则（A-T, G-C）。
- 探针制备： 设计并合成与目标核苷酸序列互补的核酸探针（通常为单链DNA或RNA）。这些探针通过化学反应或酶促反应，直接或间接地标记上荧光染料分子（荧光素）。
- 样本制备： 将待检测的细胞、组织切片（石蜡包埋或冰冻切片）或中期/间期染色体铺片固定在载玻片上，并进行特定的预处理。对于DNA检测，通常需要使用变性剂（如甲酰胺）和加热使样本DNA解旋成单链，暴露出结合位点。
- 杂交： 将变性的荧光标记探针与变性后的样本在严格控制温度、湿度和时间的条件下共同孵育。探针会寻找并与其互补的目标序列特异性结合（退火），形成稳定的双链杂交分子。
- 洗涤： 使用不同严格度的缓冲液洗去未结合的、松散结合的或非特异性结合的探针，降低背景信号，提高特异性。
- 复染与封片： 应用荧光染料（如DAPI）对细胞核或染色体进行复染，提供形态学定位背景。最后用抗淬灭封片剂封片。
- 荧光显微成像与分析： 在配备特定荧光滤光片组的荧光显微镜下观察样本。荧光标记的探针在其结合位置发出特定波长的荧光信号（明亮的点状、带状或弥散信号）。通过成像系统捕获和分析这些信号的位置、数量、大小和强度。
二、 探针类型
FISH技术的多样性和应用广度在很大程度上依赖于不同类型的探针：
- 位点特异性探针： 针对单个特定基因或基因座的探针（如检测BCR/ABL融合基因）。
- 着丝粒探针： 靶向染色体着丝粒区域高度重复序列的探针，用于计数染色体数目（如检测13、18、21、X、Y染色体的非整倍体）。
- 端粒探针： 靶向染色体末端端粒重复序列的探针（如研究端粒长度变化）。
- 染色体涂染探针： 覆盖整条或部分染色体臂的探针库（如全染色体涂抹探针，用于识别染色体易位、来源不明的标记染色体）。
- 断裂点分离探针： 设计在基因断裂热点两侧的探针（如用于ALK基因重排检测的双色分离探针），正常时信号融合（黄色），断裂易位时信号分离（红、绿分离）。
- 融合信号探针： 分别标记两个不同基因的探针，用不同颜色荧光标记（如红色标记基因A，绿色标记基因B），当发生特定融合时，产生叠加的黄色信号。
- RNA探针： 用于检测细胞质或细胞核内的特定RNA分子的表达和定位。
三、 主要应用领域
FISH以其独特优势在生物医学研究和临床诊断中应用广泛：
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染色体异常检测：
- 非整倍体筛查： 产前诊断（羊水、绒毛膜绒毛）、植入前遗传学诊断（PGD）中快速检测常见染色体数目异常（如21三体综合征）。
- 微缺失/微重复综合征诊断： 检测与特定疾病相关的微小染色体缺失（如DiGeorge综合征22q11.2缺失、Prader-Willi/Angelman综合征15q11-q13缺失）。
- 染色体结构重排分析： 精确识别和定位染色体易位、倒位、插入、环状染色体、标记染色体等复杂重排。
- 血液肿瘤遗传学： 检测慢性髓系白血病的BCR/ABL融合基因、急性髓系白血病的PML/RARA融合基因、淋巴瘤中的MYC、BCL2、BCL6重排等。
- 实体瘤遗传学： 检测乳腺癌HER2基因扩增、膀胱癌染色体3/7/17数目异常及9p21缺失、软组织肉瘤特征性易位（如EWSR1重排）、神经母细胞瘤MYCN基因扩增等。
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基因定位与图谱构建： 将特定基因或DNA序列精确定位于染色体或染色体区带上，辅助基因组物理图谱构建。
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基因表达与RNA定位研究： 在单细胞水平观察特定mRNA或非编码RNA在组织或细胞内的时空分布和表达水平。
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病原体检测： 直接在组织样本中检测和定位细菌、病毒等病原微生物的核酸（尤其在病理组织学中）。
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细胞遗传多样性研究： 研究物种进化、比较基因组学中的染色体结构和序列差异。
四、 技术优势与局限
优势：
- 高特异性与灵敏度： 能精准定位单个细胞内的特定核酸序列。
- 空间分辨率： 保留目标核酸在组织、细胞或染色体上的原始位置信息，提供形态学背景关联。
- 快速直接可视化： 结果直观，可通过显微镜直接观察和分析信号。
- 适用性广： 可用于分裂中期染色体、间期细胞核、石蜡包埋组织、冰冻切片等多种样本类型。
- 多重检测能力： 结合不同颜色荧光标记的探针，可在同一反应中同时检测多个靶标。
- 对样本质量要求相对宽松： 对于部分降解的DNA样本（如福尔马林固定石蜡包埋组织）仍能有效检测。
局限性：
- 分辨率限制： 光学显微镜的分辨率限制了其检测微小缺失/重复（小于~50-200kb）和点突变的能力。
- 需要预先知道靶标序列： 探针设计依赖于对目标序列的先验知识，无法进行全基因组无偏筛查。
- 通量相对较低： 一次实验通常只能检测少数几个预定的靶点。
- 探针成本： 某些定制探针或复杂探针组合成本较高。
- 结果解读主观性： 信号判读（尤其微弱信号或背景高时）需要经验丰富的技术人员，存在一定主观性。
- 自动化程度： 虽然自动化平台在发展，但完整流程（尤其成像分析）仍常需要人工操作和判读。
五、 发展趋势
FISH技术仍在不断发展和与其他技术融合：
- 多色FISH与光谱核型分析： 同时使用多种荧光染料标记不同探针，实现全染色体组或更多靶点的同步可视化。
- 高分辨率FISH： 结合改进的样本制备、探针标记和成像技术（如超分辨率显微镜）提高空间分辨率。
- 基于FISH的单细胞基因组学： 结合显微切割或单细胞测序等技术深入研究细胞异质性。
- 活细胞FISH： 开发更温和的探针和成像方法，在活细胞中动态追踪核酸的运动和功能。
- 定量FISH： 更精确地测量信号强度，用于基因拷贝数和表达水平的相对定量。
- 自动化与人工智能： 高通量自动化平台的开发（杂交、洗涤、成像）以及基于人工智能的图像分析和信号判读软件的应用，提高通量、标准化和客观性。
结语
荧光原位杂交技术（FISH）以其独特的优势——在细胞原位环境下直接可视化特定的DNA或RNA序列——成为连接分子生物学、细胞遗传学和组织病理学的重要桥梁。它在遗传病诊断、肿瘤分子分型、基础研究等领域发挥着不可替代的作用。尽管面临分辨率、通量等方面的挑战，但随着技术的不断创新（如超高分辨率成像、多重检测、自动化分析）和与其他组学技术的整合，FISH在未来将继续为生命科学研究和精准医疗提供强有力的空间分辨分子信息。