荧光定量PCR检测

荧光定量PCR检测：原理、应用与流程详解

荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）是一种在PCR扩增反应中实时监测荧光信号变化，从而对起始模板进行精确定量的分子生物学技术。它结合了传统PCR的高灵敏度与实时监测的定量能力，已成为生命科学、医学诊断、食品安全等领域不可或缺的核心技术。

一、核心原理：荧光的实时追踪

qPCR的核心在于利用荧光信号标记扩增产物，并在每一轮循环结束后实时检测荧光强度。随着目标DNA片段的指数级扩增，荧光信号同步增强，通过分析荧光增长曲线即可实现精确定量。主要检测模式包括：

1. 非特异性检测（染料法）：

   • 染料： 使用可嵌入双链DNA（dsDNA）小沟的荧光染料。
   • 原理： 染料游离时荧光微弱，一旦嵌入新合成的双链DNA产物中，荧光强度显著增强。
   • 特点： 成本较低、操作简便，但会与任何双链DNA结合（包括引物二聚体、非特异产物），特异性相对较低。需进行熔解曲线分析验证产物特异性。

2. 特异性检测（探针法）：

   • 探针： 设计与目标序列特异性结合的寡核苷酸探针，标记有报告荧光基团（Reporter）和淬灭荧光基团（Quencher）。
   • 原理（以水解探针为例）：
     • 探针完整时，报告基团的荧光被邻近的淬灭基团吸收（荧光共振能量转移，FRET），不发光。
     • PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性将结合在模板上的探针水解切割。
     • 报告基团与淬灭基团分离，报告荧光得以释放并被检测器捕获。
   • 特点： 特异性极高（依赖于探针的特异性结合），多重检测能力强（使用不同荧光标记的探针），背景信号低。是临床诊断的主流方法。

二、核心应用领域

1. 基因表达分析：

   • 相对定量： 比较不同样本（如处理组 vs 对照组）中特定基因mRNA的表达水平差异，需使用内参基因（管家基因）进行标准化。
   • 绝对定量： 确定样本中目标核酸分子的绝对拷贝数或浓度，需使用已知浓度的标准品绘制标准曲线。

2. 病原体检测与定量：

   • 快速、灵敏地检测和定量病毒、细菌、真菌、寄生虫等病原体核酸（DNA或RNA），用于疾病诊断（如新冠病毒、HBV、HCV、HIV）、疗效评估和流行病学监测。RNA病毒需先进行反转录（RT-qPCR）。

3. 基因分型与突变检测：

   • 利用等位基因特异性探针或熔解曲线分析（高分辨率熔解曲线，HRM），检测单核苷酸多态性（SNP）、点突变、插入/缺失等遗传变异。

4. 转基因成分检测：

   • 定性或定量检测食品、饲料、环境样品中是否存在转基因生物的特定外源基因序列。

5. microRNA分析：

   • 检测微小的非编码RNA分子，常使用特殊设计的茎环引物或加尾法进行反转录和扩增。

6. 表观遗传学研究：

   • 检测DNA甲基化水平（如甲基化特异性qPCR - MSP）。

三、标准操作流程与关键点

1. 样本制备：

   • 核酸提取： 从各种样本（血液、组织、细胞、微生物、植物、食品等）中高质量地提取目标DNA或RNA。RNA操作需严格防止RNase污染并使用无RNase耗材。提取的纯度（A260/A280, A260/A230）和完整性直接影响结果。

2. 反转录（仅用于RNA检测）：

   • 使用反转录酶将RNA模板转化为互补DNA（cDNA）。
   • 关键选择：反转录引物（随机引物、Oligo dT、基因特异性引物）影响cDNA的代表性和后续扩增效率。

3. 反应体系配制：

   • 核心组分： 模板DNA/cDNA、特异性引物对、（探针）、热启动DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、缓冲液。
   • 优化至关重要： 引物/探针浓度、镁离子浓度、退火温度等需通过预实验优化，以获得高扩增效率（90-110%）和特异性。

4. PCR扩增与实时荧光检测：

   • 将反应液置于qPCR仪器中。
   • 仪器程序通常包含：初始变性（激活酶）→ 循环（变性→ 退火/延伸）→ （熔解曲线分析）。
   • 在每个循环的退火/延伸结束时，仪器激发荧光并采集特定通道的荧光信号。

5. 数据分析：

   • 阈值线（Threshold）设置： 通常设定在指数扩增早期荧光信号显著高于背景噪音的区域。
   • Ct值（循环阈值）： PCR扩增产物荧光信号达到设定阈值所经历的循环数。Ct值与起始模板量的对数呈负线性关系（模板量越多，Ct值越小）。
   • 定量方法：
     • 绝对定量： 使用已知浓度的标准品（梯度稀释）制作标准曲线（Ct值 vs log起始量），根据待测样品的Ct值计算其绝对拷贝数或浓度。
     • 相对定量： 常用ΔΔCt法。计算待测基因与内参基因的Ct差值（ΔCt），比较不同处理组间ΔCt的变化（ΔΔCt），最终以2^(-ΔΔCt)表示目标基因的相对表达倍数变化。
   • 熔解曲线分析（染料法必需）： 在扩增结束后，缓慢升温使双链DNA解链（变性），监测荧光随温度的变化。单一、尖锐的熔解峰通常表明产物特异性好。

四、质量控制与影响因素

• 内参基因（管家基因）： 用于校正样本间加样误差、核酸提取效率差异和反转录效率差异（RNA检测）。需选择表达稳定不受实验条件影响的基因。
• 阴性对照： 无模板对照（NTC）用于监测试剂污染；无反转录对照（NRT，RNA检测）用于监测基因组DNA残留。
• 阳性对照： 已知含有目标序列的样本，确保实验体系有效。
• 扩增效率： 理想值为100%（模板每循环扩增一倍）。效率偏离（<90% 或 >110%）会影响定量准确性。可通过标准曲线的斜率评估（理想斜率≈ -3.32）。
• 抑制物： 样本中可能存在抑制PCR反应的物质（如肝素、血红素、腐殖酸、高盐分等），可通过稀释样本或优化纯化方法解决。
• 引物二聚体/非特异产物： 引物设计不佳或反应条件不优化导致。

五、未来发展与展望

qPCR技术仍在不断发展：

• 数字PCR（dPCR）： 将反应体系分割成数万个微反应单元，实现绝对定量而不依赖标准曲线，灵敏度更高，抗抑制物能力更强。
• 多重qPCR： 在同一反应管内同时定量多个目标基因，提高通量和效率，节省样本和试剂，依赖于不同荧光通道探针。
• 快速qPCR： 优化酶、试剂和仪器参数，显著缩短检测时间。
• 便携式/现场检测： 开发小型化、便携式qPCR仪，用于现场即时检测（POCT）。

结论：

荧光定量PCR凭借其高灵敏度、高特异性、宽动态范围和快速定量的优势，已成为分子生物学研究和分子诊断领域的基石技术。深入理解其原理、严谨的操作流程、规范的实验设计和审慎的数据分析，是获得可靠结果的关键。随着技术的革新，qPCR及其衍生技术将继续在生命科学和医学健康领域发挥不可替代的重要作用。