Transwell侵袭实验完整指南
一、实验原理 Transwell侵袭实验通过重构体内细胞侵袭过程，评估细胞穿越细胞外基质（ECM）屏障的能力。关键步骤包括：
- 基质胶包被：在Transwell小室顶部滤膜（孔径通常为8μm）模拟基底膜结构。
- 细胞接种：将待测细胞接种于基质胶层上。
- 趋化诱导：下室加入含趋化因子（如10% FBS）的培养液，建立浓度梯度。
- 细胞迁移与侵袭：细胞降解基质胶并迁移至滤膜下表面。
- 结果检测：固定染色后对穿过基质的细胞计数，量化侵袭能力。
与迁移实验的区别：侵袭实验需基质胶包被，模拟穿越基底膜过程；迁移实验则直接使用裸膜。
二、实验材料与试剂
- 主要耗材：Transwell小室（聚碳酸酯膜，孔径8μm）、24孔细胞培养板
- 基质成分：基底膜提取物（溶解于4℃无血清培养基）
- 细胞处理试剂：无血清培养基、胰蛋白酶、PBS
- 固定与染色：4%多聚甲醛、0.1%结晶紫染液（甲醇配制）
- 细胞培养：含血清完全培养基（下室趋化用）
三、实验步骤详解
1. 基质胶铺板 (冰上操作)
- 用预冷枪头将50μL基底膜提取物（稀释至1-2 mg/mL）均匀铺于Transwell小室上腔。
- 37℃孵育1-2小时使其聚合，形成胶状层。
2. 细胞准备
- 消化对数生长期细胞，无血清培养基重悬。
- 调整细胞密度至1-5×10⁵ cells/mL（需预实验优化）。
3. 细胞接种
- 下室加入600μL含10%血清的完全培养基作为趋化因子来源。
- 上室加入100-200μL细胞悬液（注意避免产生气泡）。
- 37℃、5% CO₂培养箱中孵育24-48小时（时间依细胞类型而定）。
4. 染色与细胞计数
- 小心移除上室液体，用棉签轻柔擦去膜上表面未侵袭细胞。
- 4%多聚甲醛固定30分钟，PBS漂洗。
- 0.1%结晶紫染色20分钟，流水轻柔冲洗。
- 风干后于光学显微镜下随机选取5个视野（200×）拍照计数。
四、关键注意事项
- 基质胶处理：始终保持低温，防止提前凝固；浓度需预实验确定。
- 细胞状态：使用对数生长期细胞，饥饿处理（无血清培养6-24小时）可增强趋化反应。
- 实验对照设置：
- 阳性对照：高侵袭性细胞系（如MDA-MB-231）
- 阴性对照：无趋化因子（下室用无血清培养基）
- 空白对照：无细胞上室
- 标准化操作：细胞计数需双盲进行，保证重复孔间一致性。
五、数据分析
- 侵袭细胞数 = 实验组平均计数 - 空白对照组计数
- 侵袭率 (%) = (侵袭细胞数 / 接种总细胞数) × 100
- 统计方法：结果以均值±标准差表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析（*p<0.05为显著性差异）。
六、常见问题与对策
七、应用价值 该实验广泛应用于：
- 肿瘤转移机制研究
- 药物抗侵袭效果评估（如加入抑制剂）
- 基因功能研究（转染后检测侵袭力变化）
- 炎症反应中免疫细胞迁移分析
八、技术发展趋势
- 活细胞成像：结合荧光标记实时观测侵袭过程
- 高通量检测：适配96孔Transwell板提高筛选效率
- 微流控芯片：构建更复杂的3D微环境模拟体内侵袭
参考文献示例 Albini, A., & Benelli, R. (2007). The chemoinvasion assay: a method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols, 2(3), 504–511. doi:10.1038/nprot.2007.54
本方案遵循标准化实验流程，通过严谨的对照设置和重复验证，可客观评估细胞侵袭动力学，为肿瘤学、免疫学等研究提供可靠数据支撑。