酶联免疫吸附（ELISA）检测

发布时间：2026-04-16 阅读量：7 作者：生物检测中心

酶联免疫吸附测定（ELISA）技术详解

一、 原理概述

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种基于抗原-抗体特异性结合反应和酶催化显色原理的高灵敏度、高特异性生物分析技术。其核心在于将抗原或抗体预先固定在固相载体（如聚苯乙烯微孔板）表面，加入待测样本后，样本中相应的抗体或抗原被捕获。随后，加入酶标记的抗体（酶标二抗）与已被捕获的抗原或抗体结合，形成“抗原-抗体-酶标抗体”复合物。洗去未结合的物质后，加入该酶的显色底物。底物在酶的催化作用下发生反应，生成有色产物。通过测定溶液的吸光度（OD值），即可对目标物进行定性或定量分析。待测物的含量与显色强度（OD值）成正比。

二、 主要类型

  1. 直接法ELISA：

    • 原理： 将已知抗原直接包被在固相载体上，加入待测样本（含特异性抗体），形成抗原-抗体复合物。然后加入酶标记的抗抗体（即抗待测抗体的抗体，如酶标抗人IgG），形成“抗原-抗体-酶标抗抗体”复合物，加底物显色。
    • 特点： 步骤相对简单，但每种待测抗体都需要特定的酶标抗抗体，灵敏度相对较低。常用于测定血清中的特定抗体。

  2. 间接法ELISA：

    • 原理： 将已知抗原包被于固相载体。加入待测样本（含特异性抗体），形成抗原-抗体复合物。洗板后，加入酶标记的二抗（即抗免疫球蛋白抗体，如酶标羊抗兔IgG），该二抗能与待测抗体（一抗）结合，形成“抗原-一抗-酶标二抗”复合物，加底物显色。
    • 特点： 最常用的ELISA类型。只需一种酶标二抗即可检测多种不同的一抗（只要一抗来自同种属），经济高效，灵敏度通常高于直接法。广泛应用于抗体检测。

  3. 双抗体夹心法ELISA：

    • 原理： 将已知的捕获抗体包被于固相载体。加入待测样本（含抗原），抗原被捕获抗体结合。洗板后，加入酶标记的检测抗体（识别抗原的另一表位），形成“捕获抗体-抗原-酶标检测抗体”复合物，加底物显色。
    • 特点： 适用于检测抗原，特别是大分子多价抗原（如细胞因子、激素、病原体蛋白）。需要一对能同时结合抗原不同表位的抗体（捕获抗体和检测抗体），特异性高，灵敏度好。不能用于检测半抗原或小分子单价抗原。

  4. 竞争法ELISA：

    • 原理：
      • 模式一（测抗原）： 将已知抗原包被于固相载体。同时加入待测样本（含未知量抗原）和一定量的酶标记抗原。两者竞争结合有限数量的包被抗原位点。洗板后，加底物显色。待测抗原含量越高，结合的酶标抗原就越少，显色越弱（OD值与待测抗原浓度成反比）。
      • 模式二（测抗体）： 将已知抗体包被于固相载体。加入待测样本（含未知量抗体）和一定量的酶标记抗原。待测抗体与酶标抗原在溶液中竞争结合包被抗体。洗板后，加底物显色。待测抗体含量越高，结合的酶标抗原就越少，显色越弱（OD值与待测抗体浓度成反比）。
    • 特点： 适用于检测小分子抗原（半抗原）或结构相似物含量较低的情况，以及某些抗体检测。灵敏度高，但操作相对复杂，标准曲线范围窄。
 

三、 基本操作步骤（以双抗体夹心法为例）

  1. 包被（Coating）： 用包被缓冲液（如碳酸盐缓冲液，pH 9.6）稀释捕获抗体至适当浓度，加入微孔板各孔中，在4°C下孵育过夜或在37°C孵育1-2小时，使抗体吸附到孔壁。
  2. 封闭（Blocking）： 倒掉或吸弃包被液。用洗涤缓冲液（如含Tween 20的PBS）洗涤微孔板数次，去除未结合的抗体。加入封闭缓冲液（如含1-5% BSA或脱脂奶粉的PBS），在37°C孵育1-2小时，封闭微孔板表面未被抗体占据的空位点，减少后续非特异性吸附。
  3. 加样与孵育（Sample & Antibody Incubation）： 倒掉封闭液，洗涤数次。加入用样本稀释液稀释的待测样本或标准品，同时设置空白孔（只加稀释液）、阴性对照孔和阳性对照孔。在37°C孵育一定时间（如1小时），使抗原与包被抗体结合。
  4. 加酶标抗体（Enzyme-Conjugated Antibody Addition）： 倒掉孔内液体，彻底洗涤数次，去除未结合的抗原。加入用稀释液稀释好的酶标检测抗体溶液，在37°C孵育一定时间（如1小时），使酶标抗体与已结合的抗原结合。
  5. 洗涤（Washing）： 倒掉孔内液体，用洗涤缓冲液充分洗涤数次（通常3-5次），彻底去除未结合的酶标抗体。洗涤不彻底是背景高和结果不稳定的常见原因。
  6. 加底物（Substrate Addition）： 加入新鲜配制的酶底物溶液（如TMB或OPD）。在室温避光条件下孵育一定时间（如15-30分钟），让酶催化底物反应生成有色产物。
  7. 终止反应（Stop Reaction）： 加入终止液（如2M H₂SO₄用于TMB），终止酶促反应。溶液颜色会发生变化（如TMB由蓝色变黄色）。
  8. 读数（Reading）： 在酶标仪上，于特定波长下（如TMB终止后通常在450nm，校正波长630nm）测定各孔的吸光度值（OD值）。
 

四、 数据分析

  1. 定性分析： 通常设定一个Cut-off值（临界值）。样本OD值大于等于Cut-off值判为阳性；小于Cut-off值判为阴性。Cut-off值常通过阴性对照的平均OD值加上2或3倍标准差确定。
  2. 定量分析：
    • 绘制标准曲线：以标准品（已知浓度）的浓度为横坐标（X轴，通常取对数），其对应的平均OD值（减去空白孔OD值）为纵坐标（Y轴），绘制标准曲线。常用四参数逻辑曲线拟合（4PL）或对数线性拟合。
    • 计算样本浓度：根据样本的OD值（减去空白孔OD值），在标准曲线上查出对应的浓度。注意样本浓度需在标准曲线的线性范围内，超出范围需稀释后重测。
 

五、 关键应用领域

  • 医学诊断： 检测病原体（病毒、细菌、寄生虫）抗体或抗原（如HIV、HBV、HCV、SARS-CoV-2、梅毒、流感）、自身抗体、肿瘤标志物（如AFP、CEA、PSA）、激素（如hCG、胰岛素、甲状腺激素）、细胞因子、过敏原特异性IgE等。
  • 生物医学研究： 蛋白质表达水平分析、蛋白质相互作用研究、信号通路研究、抗体效价测定、疫苗评价。
  • 食品安全： 检测食品中残留的农药、兽药、毒素（如黄曲霉毒素）、过敏原、致病微生物。
  • 药物研发与监测： 药物浓度监测、药代动力学研究、抗体药物检测。
  • 法医学： 体液鉴定。
  • 动植物检疫： 动植物疫病病原检测。
 

六、 优势与局限

  • 优势：
    • 高灵敏度： 可检测pg/mL甚至fg/mL水平的物质。
    • 高特异性： 依赖于抗原-抗体的精确识别。
    • 高通量： 96孔板或384孔板设计便于同时处理大量样本。
    • 操作相对简便： 流程标准化，易于自动化。
    • 结果客观定量： 通过OD值进行定量分析。
    • 应用范围极其广泛： 适用于多种生物分子的检测。
  • 局限：
    • 试剂依赖性： 抗体的质量和特异性至关重要。抗体交叉反应可能导致假阳性。
    • 耗时： 通常需要数小时甚至过夜完成。
    • 易受干扰： 样本中的嗜异性抗体、类风湿因子、溶血、脂血等可能干扰结果（假阳性/假阴性）。
    • “钩状效应”（Hook Effect）： 在双抗体夹心法中，当待测抗原浓度极高时，可能因抗原饱和了捕获抗体和检测抗体，导致形成的夹心复合物反而减少，OD值下降，造成假阴性结果。需对高值样本进行稀释复测。
    • 需要专用设备： 需酶标仪进行读数。
 

七、 质量控制与注意事项

  • 设置对照： 每次实验必须设置空白对照（仅试剂）、阴性对照（确认无目标物时的背景/特异性）、阳性对照（确认检测系统有效）、标准品系列（用于定量）。
  • 严格洗涤： 充分的洗涤是降低背景和非特异性结合的关键步骤。
  • 精确加样： 使用校准好的移液器，避免气泡产生。
  • 孵育条件： 严格控制孵育时间和温度，确保反应一致性。
  • 试剂保存与使用： 酶结合物、底物等需按说明书要求保存（常为4°C或-20°C），避免反复冻融。使用前平衡至室温。底物需现配现用。
  • 酶标仪校准： 定期对酶标仪进行波长校准和光路检查。
  • 结果判读： 严格按照设定的Cut-off值或标准曲线进行结果判读。对临界值样本或异常结果需谨慎处理，必要时复测或采用其他方法验证。
 

八、 技术发展

ELISA技术不断发展，衍生出多种改良方法以提高性能或适应特定需求，例如：

  • 化学发光ELISA（CLIA）： 用化学发光底物代替显色底物，通过检测发光信号进行定量，灵敏度通常显著高于传统显色ELISA。
  • 荧光ELISA（FIA）： 用荧光物质标记抗体或底物，通过检测荧光强度定量，灵敏度高，动态范围宽。
  • 免疫PCR： 将PCR技术引入ELISA，用DNA分子标记抗体，通过PCR扩增DNA信号，实现超高灵敏度检测。
  • 基于生物传感器/微流控芯片的ELISA： 实现小型化、快速化、自动化检测。
 

九、 常见问题解答（FAQ）

  • Q：为什么我的背景值很高？
    • A： 常见原因包括：封闭不充分（增加封闭剂浓度或时间）、洗涤不彻底（增加洗涤次数或体积、确保孔内液体完全弃净）、抗体浓度过高（优化抗体稀释度）、样本或试剂中存在干扰物质、底物污染或过期、酶标板质量问题、孵育温度/时间过长等。
  • Q：为什么标准曲线线性不好？
    • A： 可能原因：标准品配制或稀释错误、加样不准确、孵育时间/温度不一致、洗涤效果不均、酶标抗体或底物失活、酶标仪读数不稳定、孔间差异大（操作问题）等。
  • Q：样本OD值超出标准曲线范围怎么办？
    • A： 必须对样本进行适当倍数稀释后重新检测，使稀释后的样本OD值落在标准曲线的有效范围内。
  • Q：如何判断是否存在“钩状效应”？
    • A： 如果样本未经稀释时OD值低于预期或偏低，而稀释后（如1:10, 1:100）OD值反而显著升高，则高度提示存在钩状效应。应对高浓度样本进行系列稀释检测。
 

总结：

酶联免疫吸附测定（ELISA）作为一种成熟且强大的免疫分析技术，凭借其高灵敏度、高特异性、高通量及相对简便的操作，在生命科学、医学诊断、食品安全等众多领域发挥着不可替代的核心作用。深入理解其原理、熟练掌握操作步骤、严格进行质量控制并关注技术发展动态，是确保获得可靠、准确实验结果的关键。随着新材料、新标记物和新平台的不断涌现，ELISA技术将继续演进，为更广泛的应用场景提供强大的分析能力。

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