平板克隆形成

发布时间：2025-06-14 10:37:34 阅读量：7 作者：生物检测中心

平板克隆形成实验：评估细胞增殖与存活能力的金标准

平板克隆形成实验（Colony Formation Assay）是一种经典的体外细胞学技术，用于定量评估单个细胞的增殖潜能、存活能力以及对各种处理（如药物、辐射、基因操作等）的敏感性。其核心原理在于观察单个贴壁细胞在适宜条件下持续分裂，最终形成肉眼可见的细胞集落（克隆）的能力。

一、 实验原理与生物学意义

  1. 核心原理： 将低密度的单个细胞接种到培养容器中，提供充足的营养和生长空间。理论上，每个具有增殖能力的存活细胞，经过多次分裂后，可形成一个独立的克隆（通常定义为由50个或更多细胞组成的集落）。
  2. 生物学意义：
    • 增殖能力： 反映了细胞在分裂过程中维持基因组稳定性、代谢活性和分裂潜力的综合能力。
    • 克隆原性（Clonogenicity）： 指单个细胞形成克隆的能力。具有高克隆原性的细胞被认为具有较强的自我更新和增殖潜力，这与干细胞特性、肿瘤发生发展密切相关。
    • 存活能力： 细胞经处理后仍能存活并形成克隆的比例，是评估药物毒性、放射敏感性、基因编辑效应等的重要指标。
    • 群体异质性： 克隆形成能力的差异揭示了细胞群体内在的异质性。

二、 实验材料与方法

  1. 主要材料与试剂：

    • 目的细胞系（贴壁细胞）
    • 完全细胞培养基（根据细胞类型选择，如DMEM、RPMI 1640等，添加适量血清）
    • 胰蛋白酶或其他细胞消化液
    • PBS缓冲液
    • 无菌培养板（常用6孔板或60mm培养皿）
    • 结晶紫染色液（0.5%或1%，溶于甲醇或乙醇），或其他细胞染色染料（如吉姆萨染液）
    • 甲醇或甲醛固定液
    • 自动细胞计数仪或血球计数板

  2. 实验步骤：

    • 细胞准备：

      1. 取处于对数生长期、状态良好的细胞。
      2. 用消化液消化细胞，制备单细胞悬液。
      3. 用完全培养基重悬细胞，充分吹打确保单细胞分散，避免细胞团块。
      4. 关键：准确计数细胞。 使用计数工具精确计数细胞浓度。

    • 细胞接种：

      1. 根据细胞类型和实验目的（如处理浓度梯度），精确计算并稀释细胞悬液至所需接种密度。密度至关重要，过低导致克隆太少统计不可靠，过高则克隆会重叠难以区分。通常需要预实验确定合适密度（例如：肿瘤细胞常用200-1000个细胞/孔接种于6孔板）。
      2. 将计算好体积的细胞悬液轻柔、均匀地加入含有适量预热完全培养基的培养孔/皿中。轻轻十字摇晃或画圈使细胞分布均匀。注意：避免晃动导致细胞聚集在中央。
      3. 标记好分组信息（如对照、不同处理组）。

    • 细胞培养（贴壁与克隆形成）：

      1. 将接种好的培养板放入湿润、37°C、5% CO2的培养箱中培养。
      2. 让细胞静置贴壁（通常4-24小时，依细胞而定）。此期间切勿移动培养板。
      3. 贴壁后，根据实验设计加入处理因素（如药物、照射等），或更换新鲜培养基（对照组）。
      4. 定期（如每2-3天）在显微镜下观察细胞生长状态和克隆形成情况，及时更换新鲜培养基（避免吹起未贴牢的细胞或形成的克隆）。

    • 终止培养与克隆固定：

      1. 当显微镜下观察到对照组中多数克隆包含大于50个细胞（通常在培养7-14天后），即可终止培养。避免培养过久导致克隆过度生长融合。
      2. 小心吸弃培养板中的培养基。
      3. 洗涤： 用预冷的PBS轻轻漂洗细胞2次，去除残留培养基和死细胞碎片。
      4. 固定： 加入适量固定液（如100%预冷甲醇或4%多聚甲醛溶液），室温固定10-30分钟。固定后吸弃固定液。

    • 克隆染色：

      1. 吸弃固定液（若用甲醛固定，需用PBS再洗涤一次）。
      2. 加入适量染色液（如0.5%结晶紫溶液，溶于25%甲醇或其他溶剂），确保覆盖整个生长面。
      3. 室温染色15-30分钟。
      4. 小心吸弃染色液。
      5. 彻底清洗： 用流水缓慢、轻柔地冲洗培养板背面和正面数次，直至洗掉多余染料，背景干净。也可将培养板浸泡在盛水容器中轻柔漂洗。避免水流直接冲击克隆。
      6. 倒置培养板于吸水纸上晾干。

    • 克隆计数与数据分析：

      1. 肉眼或借助低倍显微镜（如解剖镜）观察。
      2. 定义克隆： 严格按照预设标准（如≥50个细胞）进行计数。肉眼可见的明显集落通常符合标准。
      3. 计数方法：
        • 人工计数： 直接在培养板/皿底部用记号笔标记已计数的克隆位置，避免重复或遗漏。建议由两人独立计数取平均值以提高准确性。
        • 软件辅助： 可拍照后使用图像分析软件（如ImageJ等）进行半自动或自动计数，需设定合适的阈值和大小参数。
      4. 计算克隆形成率：
        • PE (Plating Efficiency - 平板效率): 未处理对照组中形成的克隆数占实际接种细胞数的百分比。PE (%) = (对照组克隆数 / 对照组接种细胞数) * 100%
        • SFE (Surviving Fraction - 存活分数): 处理组细胞的克隆形成能力相对于对照组的比例。SFE = (处理组克隆数 / 处理组接种细胞数) / PE 或更常用简化公式 SFE = (处理组克隆数) / (处理组接种细胞数 * PE/100)。SFE常用于绘制细胞存活曲线（如放射生物学中的剂量-存活曲线）。
      5. 统计分析： 实验需设置重复（通常至少3个复孔），计算平均值和标准差（Mean ± SD）。使用适当的统计方法（如t检验、ANOVA）比较组间差异的显著性。

三、 关键注意事项

  1. 确保单细胞悬液： 接种前细胞悬液中存在细胞团块会严重影响结果准确性。必须充分吹打消化后的细胞，可通过细胞筛过滤去除团块。
  2. 精确的细胞计数与接种： 这是实验成败的核心。计数误差和接种体积误差都会导致巨大偏差。接种时确保细胞均匀分布。
  3. 选择合适的接种密度： 密度过高会导致克隆融合，无法区分单个克隆；密度过低则克隆数太少，统计误差大。必须进行预实验优化。
  4. 严格无菌操作： 防止污染，否则实验失败。
  5. 轻柔操作： 特别是在更换培养基和洗涤过程中，避免将贴壁不牢的细胞或早期形成的克隆冲掉。
  6. 培养时间： 培养时间不足，克隆太小难以计数；时间过长，克隆融合或细胞进入平台期/死亡。需根据细胞生长速度确定最佳终止时间。
  7. 一致的克隆计数标准： 整个实验过程（尤其是多人参与计数时）必须严格遵守预先定义的克隆大小标准（如≥50个细胞）。
  8. 设立合适的对照： 必须设置未处理的阴性对照组，有时还需设置阳性对照组（如已知对处理敏感的细胞）。
  9. 环境控制： 维持培养箱温度、湿度和CO2浓度的稳定。

四、 应用领域

平板克隆形成实验广泛应用于：

  • 肿瘤生物学： 评估肿瘤细胞的干性、恶性程度；研究癌基因/抑癌基因功能；筛选抗肿瘤药物（细胞毒性/细胞抑制作用）。
  • 放射生物学： 测定细胞对电离辐射的敏感性（经典的金标准方法），绘制剂量-存活曲线。
  • 干细胞研究： 评估干细胞的自我更新和多向分化潜能（常结合其他方法）。
  • 毒理学： 评价化学物质、环境毒素对细胞增殖的毒性效应。
  • 基因功能研究： 分析基因过表达、敲除或突变对细胞增殖和存活的影响。
  • 老化研究： 评估细胞衰老过程中的增殖能力变化。

总结：

平板克隆形成实验以其直观、可靠的特点，成为评估单个细胞增殖与存活能力的基石方法。其成功实施依赖于严格的无菌操作、精确的细胞计数接种、优化的培养条件以及对克隆计数标准的严格执行。通过计算克隆形成率和存活分数，该实验为研究细胞对遗传、化学和物理因素的应答提供了一个有力的定量工具，在基础研究和药物研发中具有不可替代的价值。