CCK-8法检测细胞增殖 完整技术指南
一、 原理
CCK-8（Cell Counting Kit-8）法是一种广泛应用于体外检测细胞增殖或细胞毒性的高灵敏度、非放射性比色检测方法。其核心原理基于水溶性四嗪盐化合物 WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）。
- 生物转化： 活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶（或其它细胞内脱氢酶）具有还原能力，能将黄色的WST-8还原生成高度水溶性的橙色甲臜（Formazan）染料。
- 定量关系： 生成的甲臜染料量与活细胞的数量呈正比，也与细胞代谢活性正相关。
- 检测方式： 使用酶标仪在特定波长（通常在450nm附近，参考波长可选600-650nm）下测定各孔溶液的吸光度值（OD值）。吸光度值越高，代表细胞增殖越旺盛或细胞毒性越低。
二、 主要试剂与材料
- CCK-8溶液： 主要成分为WST-8、电子耦合试剂（如1-Methoxy PMS）及稳定剂。通常为即用型橙红色液体，需避光保存。
- 细胞培养基： 根据实验细胞类型选择（如DMEM, RPMI-1640等），通常不含酚红，以减少背景干扰。
- 磷酸盐缓冲液（PBS）： 用于洗涤细胞。
- 胰蛋白酶溶液（或其他细胞解离试剂）： 用于贴壁细胞消化计数。
- 待测化合物/药物： 用于处理细胞（如检测药物对增殖的影响）。
- 阳性对照： 常用含血清培养基（刺激增殖）或细胞裂解液（代表100%死亡）。
- 阴性对照： 常用无细胞的培养基加CCK-8（背景空白对照）。
- 96孔细胞培养板： 规格均一，适用于酶标仪检测，首选平底透明板。
- 细胞计数仪或血球计数板： 用于精确计数细胞。
- 二氧化碳细胞培养箱： 提供恒温（通常37°C）、恒湿及一定浓度CO2（通常5%）的环境。
- 酶标仪： 用于读取450nm处的吸光度值。
三、 实验步骤（贴壁细胞示例）
- 细胞准备：
- 消化对数生长期的细胞，用含血清培养基重悬。
- 计数，用完全培养基调整至所需浓度（需根据细胞类型、生长速度、处理时间通过预实验确定，通常在每孔1000-10000个细胞范围内）。
- 铺板：
- 将100μL细胞悬液接种到96孔板的相应孔中（边缘孔通常用无菌PBS或培养基填充，以减少蒸发引起的边缘效应）。
- 设置空白孔（仅培养基，无细胞）、对照组（未处理细胞）和实验组（不同浓度药物处理）。
- 每组设置至少3个复孔。
- 轻晃板混匀。
- 预培养：
- 将培养板置于37°C、5% CO2培养箱中预培养一定时间（如24小时），让细胞贴壁并恢复。
- 药物处理（如适用）：
- 吸弃旧培养基（小心操作避免损伤贴壁细胞）。
- 加入含不同浓度药物的新鲜培养基100μL/孔（或直接加入适量药物溶液，注意体积小则需预混合）。
- 对照组加入等体积不含药物的培养基或溶剂对照。
- 放回培养箱继续培养预定时间（如24, 48, 72小时）。
- 加入CCK-8溶液：
- 在每孔中加入10μL CCK-8溶液（建议加入量为培养基体积的10%，即100μL培养基加10μL CCK-8）。使用多通道移液器确保加样速度和均匀性。
- 轻微摇晃培养板数次，使试剂混匀。
- 孵育：
- 将培养板放回37°C、5% CO2培养箱中避光孵育。孵育时间至关重要，需通过预实验确定（通常1-4小时）。时间过长可能导致甲臜结晶沉淀或细胞死亡产生假象。
- 检测吸光度：
- 孵育结束后，取出培养板。
- 轻微振荡混匀孔内液体。
- 使用酶标仪，设定检测波长为450nm（主波长），参考波长通常设为600nm或650nm（用于扣除非特异性吸光背景）。
- 立即读取各孔的吸光度值（OD450）。
四、 结果计算与分析
- 数据处理：
- 计算每个处理组的平均OD值（扣除空白孔平均值）。
细胞存活率/增值率 (%) = [ (OD实验组 - OD空白组) / (OD对照组 - OD空白组) ] × 100%- 对照组： 通常指未加药物处理的正常细胞组的平均OD值（已扣除空白）。
- 实验组： 指加入药物处理的细胞组的平均OD值（已扣除空白）。
- 空白组： 仅含培养基和CCK-8，无细胞的孔的平均OD值。
- 统计分析：
- 数据通常表示为均值 ± 标准差（SD）或标准误（SEM）。
- 使用适当的统计软件（如GraphPad Prism, SPSS）进行显著性检验（如t检验、ANOVA分析），比较不同处理组与对照组之间的差异。
五、 注意事项与关键点
- 细胞状态： 使用对数生长期、状态良好的细胞，确保实验前细胞活性>95%。
- 铺板均一性： 细胞悬液要充分混匀，保证每孔细胞数量一致。避免气泡干扰。
- 边缘效应： 96孔板边缘孔蒸发快，可能导致结果偏差。建议边缘孔加PBS或培养基不用于正式实验数据采集（仅用于保湿），或使用专门的防蒸发板盖。
- 孵育条件： CCK-8反应高度依赖温度（必须是37°C）和孵育时间。时间过长会导致OD值过高甚至沉淀；时间过短则灵敏度不足。必须通过预实验确定最佳孵育时间（使对照孔OD值在0.8-1.2左右较为理想）。
- 避光： WST-8和甲臜对光敏感，实验过程（特别是孵育和读数前）应尽量避免强光直射。孵育时培养板可置于避光盒或用铝箔包裹。
- 加样体积： 确保加入的CCK-8体积准确且一致（推荐培养基体积的10%）。体积偏差会导致数据波动。
- 加样动作： 加CCK-8时，建议将枪头尖端浸入液面下加入，避免直接滴在孔壁或细胞上（特别是贴壁细胞），可能引起局部浓度过高或细胞损伤。
- 读数前混匀： 读数前必须轻轻振荡混匀孔内溶液，避免孔底沉淀导致读数不准确。
- 试剂保存： CCK-8溶液需避光保存在4°C冰箱（0-5°C）。使用前需平衡至室温并混匀。避免反复冻融。
- 细胞密度优化： 不同细胞类型、不同培养时间所需的最适接种密度差异很大。必须进行预实验确定接种密度和CCK-8孵育时间，以保证终点时对照组OD值在仪器线性范围内（通常0.8-1.2），且增殖/抑制效果明显。
- 干扰物质： 某些具有强还原性的化合物（如维生素C、谷胱甘肽）、高浓度的蛋白质或脂类可能会干扰检测结果。需要进行对照实验评估干扰程度（如设置含药物不含细胞的孔）。
- 无菌操作： 整个加样过程需在超净台内进行无菌操作，防止污染。
六、 应用特点
- 优点：
- 灵敏度高：优于传统的MTT法。
- 操作简便快捷：一步法添加，无需后续溶解步骤。
- 重现性好。
- 对细胞毒性小，可直接用于长时间、多时间点监测。
- 水溶性产物： 生成的甲臜高度水溶，无需有机溶剂溶解（如MTT法所需的DMSO或酸化SDS），避免了溶解操作带来的误差和危险。
- 非放射性，安全性高。
- 适用于高通量筛选。
- 局限性：
- 成本相对较高（主要试剂）。
- 受细胞代谢活性影响，反映的是细胞活性而非绝对细胞数。
- 不能区分细胞增殖和细胞死亡减少。
- 高密度细胞可能导致孵育后期营养耗尽或代谢废物积累，影响结果。
- 存在干扰物质的可能性。
- 需要酶标仪。
七、 总结
CCK-8法因其灵敏度高、操作简便、结果稳定可靠且无放射性危害，已成为体外评估细胞增殖、细胞活性和化合物细胞毒性的首选标准方法之一。严格遵循标准化的操作流程（特别是细胞密度、孵育时间的优化，注意避光和均一性），并充分考虑可能的干扰因素，是获得准确、可靠实验结果的关键。其结果通常用于比较不同处理条件下细胞的相对活力或增殖能力。
请注意： 具体实验条件（如细胞接种密度、药物处理浓度和时间、CCK-8孵育时间）需研究者根据自身实验体系和目的进行详细优化和验证。本指南提供的是通用流程和关键注意事项。