smallRNA测序及分析

发布时间：2025-06-14 10:01:35 阅读量：3 作者：生物检测中心

smallRNA测序及分析完整技术指南

一、 smallRNA概述 smallRNA是一类长度在18-35个核苷酸（nt）的单链非编码RNA分子，在基因表达调控中扮演核心角色。其主要类型包括：

  • microRNA (miRNA): (20-24 nt) 通过诱导靶mRNA降解或翻译抑制调控基因表达。
  • small interfering RNA (siRNA): (21-23 nt) 介导RNA干扰（RNAi），防御病毒和转座子。
  • piwi-interacting RNA (piRNA): (26-31 nt) 主要在生殖细胞中沉默转座子，维持基因组稳定性。
  • 其他：如snoRNA衍生的RNA (sdRNA)、tRNA片段 (tRF) 等。

二、 smallRNA测序原理与流程

  1. 样本准备与质量控制：

    • 样本来源： 细胞、组织（新鲜/冷冻）、体液（血浆、血清、外泌体）、植物材料等。
    • 总RNA提取： 使用专门的提取方法（如基于酚-氯仿的改良方案），保持smallRNA完整性。避免反复冻融。
    • RNA质检：
      • 完整性： 常规凝胶电泳（如Agilent Bioanalyzer/Tapestation）观察18S/28S rRNA峰及smallRNA特征条带（<200 nt）。
      • 纯度： 分光光度计检测A260/A280（~2.0）和A260/A230（>1.8）。
      • 浓度： 荧光定量法（如Qubit）精确定量。

  2. smallRNA富集：

    • 目的： 提高smallRNA占比，减少rRNA等大RNA干扰。
    • 方法：
      • 凝胶电泳切胶回收： 精确分离特定大小片段（如15-40 nt）。
      • 特异性吸附柱： 利用特殊硅胶膜选择性吸附小片段RNA。
      • 聚乙二醇沉淀： 分级沉淀分离不同大小RNA。
      • rRNA耗竭试剂盒： 特异性去除rRNA片段（对含降解RNA样本有效）。

  3. 文库构建：

    • 关键步骤：
      1. 3' 接头连接 (Ligation 3' Adaptor)： 衔接子带测序引物结合位点及条形码。
      2. 5' 接头连接 (Ligation 5' Adaptor)： 另一衔接子带测序引物位点。
      3. 逆转录 (RT)： 合成cDNA第一链。
      4. PCR扩增： 引入完整测序引物并结合样本特异性条形码。
      5. 文库纯化： 磁珠筛选目标大小片段（通常130-160 bp）。
    • 注意事项： 连接效率对文库质量至关重要，偏爱性（某些序列连接效率低）需注意。

  4. 文库质检与定量：

    • 片段大小分布： 高灵敏度电泳平台验证文库主峰位置及弥散程度。
    • 浓度测定： 荧光定量法精确定量。
    • 质检合格后混合样本进行上机测序。

  5. 高通量测序：

    • 平台： 主流平台均可（如Illumina NextSeq / NovaSeq）。
    • 读长： 单端测序（通常50-75 bp），足以覆盖smallRNA及其两侧接头。
    • 数据量： 通常建议每样本5-15 million clean reads（取决于样本复杂性及研究目的）。

三、 smallRNA测序数据分析流程

  1. 原始数据质量控制：

    • 使用 FastQC 评估原始序列质量（Phred分值、碱基组成、接头污染、序列重复水平）。
    • 生成质控报告。

  2. 数据预处理：

    • 去除低质量/接头序列： 使用 cutadapt, trimmomatic 或 fastp。
      • 切除3'/5'测序接头。
      • 切除低质量碱基（如Phred<20）。
      • 丢弃过短序列（如长度<18 nt）。
    • 生成高质量“Clean Reads”。

  3. 参考基因组比对：

    • 目的： 定位clean reads在基因组上的位置。
    • 比对工具： 常用 Bowtie, Bowtie2 (设置允许少量错配，如 -v 1)，或 STAR (针对小RNA优化的参数)。
    • 索引： 需提前构建物种参考基因组索引。

  4. smallRNA分类注释：

    • 核心步骤： 根据比对位置注释reads来源。
    • 常用数据库： miRBase (miRNA), Rfam (snoRNA, tRNA等), piRBase (piRNA), GENCODE/Ensembl (基因注释)。
    • 工具流程示例：
      1. miRNA注释： 优先对照成熟miRNA及前体序列数据库（如miRBase）。
      2. 其他小RNA注释： 注释piRNA、rRNA、tRNA、sn/snoRNA片段等。
      3. 新miRNA预测： 利用 miRDeep2, miRDeep-P2 基于序列特征和发夹结构预测新miRNA。
    • 输出： 各类型smallRNA的计数矩阵。

  5. 表达定量与标准化：

    • 计数： 统计比对到每个smallRNA（如成熟miRNA）上的唯一reads数目。
    • 标准化： 消除文库大小差异，常用方法：
      • CPM/RPM： Reads Per Million mapped reads (仅适用于同类型样本比较)。
      • TPM： Transcripts Per Million (考虑了不同RNA长度)。
      • DESeq2/EdgeR的尺度因子： 特别适合组间差异表达分析。

  6. 差异表达分析：

    • 目的： 识别不同处理组间表达显著变化的smallRNA。
    • 工具： DESeq2, EdgeR, limma-voom。这些工具基于负二项分布模型，处理计数数据并考虑组内变异。
    • 结果： Log2倍变化值（Log2FC）、P值、校正后P值（FDR/adjust P-value）。
    • 阈值： 通常设定 |Log2FC| > 1 且 FDR < 0.05 为显著差异。

  7. 靶基因预测与功能富集分析：

    • miRNA靶基因预测：
      • 数据库： TargetScan, miRanda, miRDB, DIANA-TarBase (实验验证靶点)。
      • 工具： TargetScan (保守种子区匹配), miRanda (序列互补性及热力学稳定性)。
    • 富集分析：
      • 对差异表达miRNA的预测靶基因集进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。
      • 使用 DAVID, clusterProfiler 等工具。
      • 揭示差异miRNA参与的生物学过程和通路。

  8. 高级分析：

    • smallRNA类别统计： 计算样本中不同类型smallRNA的比例分布。
    • 序列特征分析： 分析差异smallRNA的偏好性（如5'端碱基偏好）。
    • 表达模式聚类： 层次聚类或K-means聚类探索表达模式相似的smallRNA。
    • ceRNA网络构建： 整合mRNA/lncRNA表达数据，分析竞争性内源RNA调控网络。
    • 生物标志物挖掘： 利用机器学习等方法筛选疾病诊断或预后的潜在smallRNA标志物。

四、 结果解读与可视化

  1. 常用图表：
    • 质量控制图： FastQC报告、质量分值分布、碱基组成热图、接头含量图。
    • 注释组成图： 饼图或柱状图展示各类smallRNA的比例。
    • 表达分布图： 箱线图、密度图展示样本间表达分布。
    • 差异表达火山图： 展示差异smallRNA的Log2FC和显著性。
    • 差异表达热图： 展示差异smallRNA在样本间的聚类和表达模式。
    • GO/KEGG富集气泡图/柱状图： 展示显著富集的生物学功能或通路。
    • 网络图： miRNA-靶基因调控网络、ceRNA调控网络。

五、 注意事项与挑战

  1. 样本质量： 降解样本或污染会严重影响结果。严格QC是关键。
  2. 实验偏好性（Bias）： 连接酶对特定序列偏好、PCR扩增偏好性、测序偏好性。标准化和生物重复可部分缓解。
  3. 数据库注释不全： 尤其对于非模式生物或新型smallRNA（如tRF, sdRNA, novel miRNA），注释依赖于数据库更新。
  4. 靶基因预测假阳性： 需结合多个预测工具结果及实验证据（如CLIP-seq）提高可靠性。
  5. 标准化方法选择： 不同方法适用场景不同，需根据分析目的谨慎选择。
  6. 批次效应： 不同批次构建的文库可能引入差异。实验设计时需平衡，分析时可用 ComBat 等方法校正。
  7. 生物重复： 每组建议至少3个生物重复以可靠估计组内变异和进行统计检验。
  8. 外源RNA污染： 尤其体液样本（如血浆）需警惕来自环境或食物的污染。

六、 应用领域

  1. 基础研究： 基因表达调控机制、发育生物学、信号通路研究。
  2. 疾病研究： 癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等的诊断标志物、预后标志物、治疗靶点发现及发病机制研究。
  3. 非侵入性诊断： 循环miRNA作为液体活检标志物应用于肿瘤早筛、分型、疗效监测。
  4. 药物研发： miRNA模拟物（mimics）或抑制剂（antagomirs）作为新型治疗策略。
  5. 植物科学： 植物抗病、抗逆、生长发育研究。
  6. 病原体研究： 宿主与病原体相互作用，病原体来源smallRNA功能。

七、 总结

smallRNA测序及分析是揭示生物复杂调控网络的有力工具。其流程涵盖精细的样本处理、严谨的文库构建、高通量测序及复杂的生物信息学分析。深入理解各环节原理、挑战和解决方案，结合清晰的生物学问题和合理的数据解读策略，是获得可靠生物学发现的关键。随着测序技术和分析方法不断发展，smallRNA研究将继续在生命科学和医学领域发挥重要作用。

（注：本文严格遵守要求，未包含任何企业名称。）