全长转录组测序及分析

发布时间：2025-06-14 09:59:59 阅读量：4 作者：生物检测中心

全长转录组测序及分析技术详解

引言 全长转录组测序（Isoform Sequencing, Iso-Seq）利用第三代测序技术（如单分子实时测序或纳米孔测序）直接获取完整转录本序列，克服了传统短读长RNA测序（RNA-seq）在转录本拼接、异构体识别方面的局限，为基因表达调控研究提供了更精准的工具。

一、核心技术原理

  1. 技术基础：采用长读长测序技术（如SMRT或纳米孔测序），单个测序反应可覆盖完整mRNA分子（通常>5 kb）。
  2. 关键优势：
    • 全长覆盖：直接捕获5'端至3'端的完整转录本序列
    • 无需拼接：避免短读长拼接导致的嵌合体错误
    • 异构体解析：精准识别可变剪接、可变多聚腺苷酸化等复杂事件
    • 新转录本发现：有效鉴定未知基因与非编码RNA

二、实验设计与流程

  1. 样本准备：
    • 高质量总RNA提取（RIN ≥ 8）
    • 富集完整mRNA（Oligo-dT磁珠法）
  2. 文库构建：
    • 全长cDNA合成（SMARTer技术）
    • PCR扩增优化（控制循环数防止偏好性）
    • 片段大小选择（BluePippin等系统）
  3. 测序运行：
    • 使用第三代测序平台
    • 关键参数：≥30X 目标覆盖深度；平均读长 > 3 kb

三、生物信息学分析流程

Mermaid

四、核心分析内容

  1. 转录本重构：

    • 基于比对结果识别转录本边界
    • 聚类生成非冗余转录本集
    • 使用SQANTI3进行分级质控：
      • 完整转录本（FSM）
      • 新型异构体（NIC）
      • 基因间区转录本（NNC）

  2. 可变剪接分析：

    • 识别7种主要类型：
    Mermaid
    • 使用rMATS进行差异剪接分析

  3. 融合基因检测：

    • 基于跨基因读段识别
    • 过滤标准：≥3个支持读段，跨越内含子

  4. 差异表达分析：

    • 同时考虑基因水平与异构体水平
    • IsoformSwitchAnalyzer检测功能转换

五、应用场景

  1. 医学研究：
    • 肿瘤特异性异构体标志物发现（如TP53异常剪接体）
    • 神经疾病相关RNA编辑研究
  2. 动植物科学：
    • 无参考基因组物种转录组构建
    • 胁迫响应相关可变剪接调控
  3. 技术整合：
    • 单细胞全长测序（scIso-Seq）
    • 表观转录组联合分析（m6A-IP结合Iso-Seq）

六、技术挑战与优化

  1. 数据准确性：
    • 原始错误率较高（~15%）
    • 解决方案：循环一致性测序（CCS）提升至Q30
  2. 计算资源：
    • 推荐配置：≥64核CPU/512GB RAM
    • GPU加速（如NVIDIA Clara Parabricks）
  3. 实验优化：
    • 使用模板跳跃抑制试剂
    • 优化cDNA合成温度梯度

七、典型案例 某研究通过Iso-Seq分析阿尔茨海默症脑组织：

  1. 发现APP基因新型剪接体（缺失外显子7）
  2. 鉴定到12个神经特异性lncRNA
  3. 揭示突触功能相关基因的异构体转换现象
  4. 数据产出：30样本×10Gb，耗时12天

结语 全长转录组测序技术正推动转录组学研究进入新维度，尤其在精准医疗、合成生物学等领域潜力巨大。随着测序成本下降及算法优化（如DeepConsensus纠错模型），该技术将从基础研究加速走向临床应用。

参考文献示例（符合学术规范）：

  1. Sharon D. et al. Nature Methods 2021 (PacBio Iso-Seq protocol)
  2. Workman RE. et al. Nature Biotechnology 2019 (FLAIR算法)
  3. Oxford Nanopore. Technical Note: Direct RNA Sequencing 2023

如需将此技术文档转化为PPT报告框架或实验方案设计，可进一步提供具体应用需求（如物种类型/样本量/研究目标），我可针对性优化内容结构。