互作转录组测序及分析

发布时间：2025-06-14 09:57:33 阅读量：6 作者：生物检测中心

互作转录组测序及分析：揭示生物相互作用的分子对话

摘要： 互作转录组学（Interaction Transcriptomics）专注于研究两种或多种生物（如宿主-病原体、共生体、捕食者-猎物）或细胞类型在相互作用状态下各自的基因表达谱及其动态变化。通过高通量测序技术，它能系统性地揭示相互作用双方在分子层面的响应机制、调控网络和关键信号通路，为理解复杂生物互作关系提供核心数据支撑。

一、 核心概念与原理

  1. 定义： 互作转录组测序是指同时对处于相互作用状态下的不同生物实体（如物种A与物种B）或细胞群体（如肿瘤细胞与免疫细胞）的转录本（mRNA, ncRNA等）进行高通量测序和分析。
  2. 核心目标： 解析在互作条件下：
    • 各方基因表达的差异（Differentially Expressed Genes, DEGs）。
    • 各方特有的基因表达模式。
    • 各方基因表达变化的时序动态。
    • 潜在的跨物种/细胞类型的基因调控网络（如宿主基因调控病原体基因，反之亦然）。
    • 与互作表型（如致病、共生、抵抗）相关的关键基因和通路。
  3. 关键挑战：
    • 样本分离/溯源： 准确分离或区分来自互作双方（或多方）的RNA分子是首要难点。常用策略包括：
      • 物理分离： 利用细胞大小、密度、表面标记等差异进行物理分选（如流式细胞术、显微解剖），再进行独立建库测序。
      • 序列区分： 若互作双方的基因组序列已知且差异足够大，测序后可根据序列比对将Reads精确归属到各自来源（即“溯源”）。这是目前最主流的方法。
      • 特异性探针/引物： 设计针对特定物种的探针或引物进行富集或扩增（应用较少）。
    • 混杂效应控制： 区分基因表达变化是真正由互作引起，还是单纯由环境或处理条件引起。严谨的实验设计（如设置单培养/单独状态对照）至关重要。
    • 生物学重复： 个体差异和生物异质性显著，设置足够且独立的生物学重复是保证结果可靠性和统计检验功效的基础。

二、 实验设计与流程

  1. 定义互作系统： 明确研究对象（如水稻-稻瘟病菌、根瘤菌-豆科植物、癌组织微环境中的不同细胞群）。
  2. 实验设计：
    • 分组： 必须包含关键组别：
      • 互作组： 物种A与物种B共培养/共处理组。
      • 单控组A： 物种A单独培养/处理组（作为物种A的对照）。
      • 单控组B： 物种B单独培养/处理组（作为物种B的对照）。
      • (可选) 时间序列组： 在互作的不同时间点取样，研究动态过程。
      • (可选) 处理组： 施加特定处理（如药物、环境胁迫）以研究其对互作的影响。
    • 生物学重复： 每组至少3个（强烈建议≥5个）独立来源的生物学重复样本，以评估变异性和进行统计检验。
    • 取样策略： 精确控制互作时间点、环境条件（温度、光照、培养基等），确保样本间可比性。
  3. 样本采集与RNA提取：
    • 严格按照实验设计在特定时间点取样。
    • 根据分离策略：
      • 物理分离： 快速有效地分离双方细胞/组织，分别提取高质量总RNA（注意RNA酶污染和降解）。
      • 序列区分： 提取互作系统的总RNA（包含双方RNA）。
    • RNA质量严格质检（RIN值 ≥ 7-8）。
  4. 文库构建与高通量测序：
    • 使用链特异性建库方法，保留转录本方向信息。
    • 构建Illumina平台兼容的cDNA文库（如TruSeq Stranded mRNA）。
    • 根据研究深度和广度确定测序通量（通常≥20-30M clean reads per sample）。
    • 进行高通量双端测序（常见150bp PE）。

三、 生物信息学分析流程

(以下流程适用于“序列区分”策略，物理分离策略双方独立分析其标准转录组流程)

  1. 原始数据质控：
    • 使用FastQC评估原始测序数据质量。
    • 使用Trimmomatic, Cutadapt等工具去除低质量碱基、接头序列。
    • 再次质控，获得高质量Clean Reads。
  2. Reads溯源：
    • 核心步骤： 将Clean Reads分别比对到互作双方各自的参考基因组上。
    • 工具： HISAT2, STAR, Bowtie2等。
    • 关键考量：
      • 精确评估比对到唯一基因组（Uniquely mapped）、比对到多个位置（Multi-mapped）、未比对（Unmapped）的reads比例。
      • 设置严格的比对参数以减少交叉比对（Cross-mapping）。交叉比对是主要误差来源，尤其当双方基因组存在同源区时。
      • 利用比对结果将每条Read明确归属到物种A、物种B或无法确定（通常丢弃）。(有时允许存在少量交叉比对reads用于特定分析，需明确说明)。
  3. 基因表达定量：
    • 基于溯源结果，分别对归属于物种A和物种B的Reads进行计数。
    • 使用featureCounts, HTSeq-count等工具，根据基因注释文件（GTF/GFF）统计比对到每个基因上的Reads数。
    • 获得原始表达矩阵（Raw count matrix）。
  4. 表达矩阵质控与标准化：
    • 评估样本间相关性（如PCA图）、整体表达分布、文库大小差异。
    • 使用DESeq2（推荐，基于负二项分布模型）、edgeR或limma-voom等工具进行标准化（如DESeq2的median of ratios方法），消除技术噪音（测序深度、文库组成差异等）。
  5. 差异表达基因分析：
    • 核心分析： 使用DESeq2/edgeR/limma等工具分别对物种A和物种B进行分析：
      • 比较互作组 vs 其单控组：鉴定物种A/B在互作状态下自身基因表达的变化（DEGs_A@Interaction, DEGs_B@Interaction）。
      • (可选) 比较不同时间点、不同处理组间的差异。
    • 设定显著性阈值：通常FDR ≤ 0.05（或更严格）且 |log2(FoldChange)| ≥ 1。
    • 生成火山图、热图可视化结果。
  6. 功能富集分析：
    • 对鉴定出的DEGs集合：
      • GO富集分析： 确定显著富集的生物学过程、细胞组分和分子功能。
      • KEGG/Reactome/其他通路分析： 确定显著富集的信号通路和代谢通路。
    • 揭示互作过程中各方的核心生物学响应模块（如免疫反应、代谢重塑、胁迫响应）。
    • 工具：clusterProfiler, DAVID, GSEA等。
  7. 互作特异性分析（高级）：
    • 比较双方DEGs： 分析双方响应基因在功能上的关联或互补性（如宿主免疫通路激活对应病原体毒力基因上调）。
    • 加权基因共表达网络分析： 利用WGCNA分别或联合分析双方基因表达数据，构建共表达模块，识别与互作表型高度相关的核心基因模块及其关联性。
    • 预测调控网络： 结合转录因子结合位点预测、启动子分析等，推测潜在的跨物种调控关系（如宿主microRNA靶向病原体基因）。
    • 整合多组学数据： 如有代谢组、蛋白组数据，进行关联分析，构建更完整的互作机制图谱。

四、 应用领域

  1. 宿主-病原体/寄生虫互作： 揭示感染机制、病原体毒力因子、宿主防御应答、耐药性产生等。
  2. 共生互作： 研究植物-根瘤菌固氮、植物-菌根真菌营养交换、肠道微生物-宿主互作（肠道转录组）等互利机制的分子基础。
  3. 捕食者-猎物互作： 探索捕食策略相关基因及猎物防御响应基因。
  4. 肿瘤微环境： 分析肿瘤细胞、免疫细胞（T细胞、巨噬细胞等）、成纤维细胞等不同细胞群体在肿瘤发生发展过程中的相互作用和信号交流。
  5. 环境胁迫下的互作： 研究生物在干旱、高温、盐碱等胁迫条件下互作响应的变化。

五、 优势与局限

  • 优势：
    • 系统性： 全局性揭示互作双方的转录组响应，无偏向性。
    • 高灵敏度： 可检测低丰度转录本。
    • 揭示动态变化： 时间序列设计可捕捉基因表达的时序动态。
    • 发现新机制： 有助于发现未知的互作相关基因和通路。
  • 局限：
    • 依赖参考基因组： “序列区分”策略要求双方有高质量、注释良好的参考基因组。
    • 交叉比对误差： 同源基因导致的交叉比对是分析准确性的主要威胁。
    • 时空分辨率有限： 普通转录组反映的是群体细胞在特定时间点的平均状态，难以精确到单细胞或亚细胞区域水平（空间转录组或scRNA-seq可部分弥补）。
    • 转录后调控： 仅反映mRNA水平，不能直接等同于蛋白水平或功能状态。
    • 成本与分析复杂度： 实验和生物信息学分析成本较高，流程复杂。

六、 结论

互作转录组测序及分析是解析生物间复杂相互作用分子机制的有力工具。通过严谨的实验设计、精确的样本分离/序列溯源策略以及系统的生物信息学分析流程，能够深入揭示互作双方基因表达的协同、拮抗或特异性变化，识别关键调控基因和通路，为理解从病原微生物侵染到共生互利、从肿瘤免疫逃逸到生态系统平衡等诸多重要生物学过程提供分子层面的深刻见解。随着测序技术的迭代升级（如长读长测序提高溯源准确性）、单细胞和空间转录组技术的整合应用以及更先进的计算模型开发，互作转录组学将在更精细的时空维度上描绘生命相互作用的壮丽图谱。

关键参考文献方向：

  • Westermann, A. J., Gorski, S. A., & Vogel, J. (2012). Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology.
  • Bálint, M., et al. (2015). Millions of reads, thousands of taxa: microbial community ecology in the era of high-throughput sequencing. Molecular Ecology.
  • Love, M. I., Huber, W., & Anders, S. (2014). Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology.
  • Langfelder, P., & Horvath, S. (2008). WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics.
  • ​Kawahara, Y., et al. (2012). Simultaneous RNA-seq analysis of a mixed infection of three unrelated viruses in a sweetpotato plant. The Plant Journal.