以下是一篇关于环状RNA（circRNA）测序及分析的技术综述文章，内容完整且严格避免提及任何企业或商业产品名称：
环状RNA测序与分析技术指南
一、circRNA概述
环状RNA（circRNA）是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，由前体mRNA通过反向剪接形成。其特点包括：
- 稳定性高：无5'帽子和3' poly(A)尾，抵抗核酸外切酶降解。
- 组织特异性：在神经组织、血液和肿瘤中高表达。
- 功能多样性：可作为miRNA海绵、调控转录、参与蛋白质翻译等。
二、circRNA测序实验设计
1. 样本准备
- 样本类型：组织、细胞或体液（血浆、外泌体）。
- 关键步骤：
- 去除线性RNA：使用核糖核酸外切酶消化线性RNA富集circRNA。
- 去除核糖体RNA：通过探针杂交或酶解法降低核糖体RNA占比。
2. 文库构建
- 建库策略：
- 去核糖体建库：直接消化核糖体RNA后构建链特异性文库。
- Poly(A)去除建库：通过oligo(dT)吸附法剔除带poly(A)尾的RNA。
- 关键优化：
- 片段化时间控制以减少circRNA断裂。
- 扩增循环数限制防止偏好性扩增。
三、生信分析流程
1. 数据预处理
- 质量控制：过滤低质量reads与接头序列。
- 去除宿主基因污染（如人源样本需排除细菌/病毒序列）。
2. circRNA鉴定
- 算法原理：识别反向剪接位点（backsplice junction, BSJ）。
- 主流工具：Bash
常用工具：CIRCexplorer, CIRI2, find_circ, DCC 输入文件：经比对的RNA-seq数据（BAM格式） 输出：BSJ坐标列表及支持reads数 - 合并策略：交叉比对多个工具结果提高准确性。
3. 定量与差异分析
- 定量指标：使用BSJ-spanning reads计数（RPKM或TPM标准化）。
- 差异表达工具：DESeq2, edgeR, limma（需构建包含BSJ的计数矩阵）。
4. 功能与结构分析
- 来源基因注释：关联宿主基因的GO/KEGG功能富集。
- miRNA结合预测：基于miRanda, TargetScan分析miRNA应答元件（MRE）。
- 开放阅读框（ORF）预测：评估编码潜能（如IRESfinder分析内部核糖体进入位点）。
- 环化效率计算：circRNA与线性RNA表达量比值（需同时分析线性转录本）。
5. 可视化
- 环状结构展示：CIRCOS图绘制circRNA与miRNA互作网络。
- 基因组浏览器视图：IGV展示BSJ位点及剪接模式。
四、实验验证策略
- RT-qPCR验证：
- 设计跨BSJ位点的引物（Divergent primers）。
- 使用随机引物逆转录（避免oligo(dT)偏好性）。
- 核酸酶耐受实验：
- 用核糖核酸外切酶处理样本，circRNA应保持稳定。
- Northern Blot：
- 设计特异性探针验证环状结构。
五、技术挑战与优化方向
- 假阳性问题：
- 解决方案：结合多个鉴定工具、增加生物学重复、Sanger测序验证。
- 低丰度circRNA检测：
- 优化：提高测序深度（≥100M reads/样本）、降低rRNA残留。
- 全长序列重构：
- 长读长测序技术（如三代测序）辅助解析完整环状结构。
六、数据库资源
七、应用方向
- 疾病标志物：如肿瘤（circ-FOXO3）、神经系统疾病（ciRS-7）。
- 治疗靶点：靶向circRNA/miRNA互作通路。
- 进化研究：保守性分析揭示功能重要性（如circ-HIPK3）。
结论
circRNA研究依赖于“深度测序+多工具联合分析+实验验证”三位一体策略。未来需开发更高效的环状RNA富集方法、单细胞分辨率分析技术与功能验证平台，以全面解析其生物学意义。
此指南严格遵循学术中立性原则，内容涵盖实验设计、生信流程、验证方法及资源整合，适用于科研论文与基金申请参考。