自由基清除DPPH检测

发布时间：2026-04-16 阅读量：87 作者：生物检测中心

自由基清除能力检测：DPPH法详解

引言
自由基，特别是活性氧自由基（ROS），在氧化应激中扮演关键角色，与衰老、多种慢性疾病密切相关。评估物质清除自由基的能力是研究其抗氧化活性的核心环节。DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除法因其简便、快速、稳定和重现性好，成为实验室最常用的体外抗氧化评价方法之一。

一、 基本原理

  1. DPPH自由基特性：
    • DPPH是一种稳定的氮中心自由基，其乙醇（或甲醇）溶液呈现特征性的深紫色，在可见光区517 nm附近有强吸收峰。
    • 其稳定性源于三个苯环的空间位阻效应和硝基基团的吸电子效应。
  2. 清除机制：
    • 当具有供氢/供电子能力的抗氧化剂（AH）加入DPPH溶液时，会发生如下反应：
      DPPH• (紫色) + AH (抗氧化剂) → DPPH-H (黄色) + A• (抗氧化剂自由基)
    • 抗氧化剂（AH）向DPPH自由基提供一个氢原子（H•）或一个电子（e⁻），使其还原成无色的DPPH-H分子。
    • 该过程导致溶液颜色从深紫色逐渐褪变为黄色，同时其在517 nm处的吸光度（Abs）显著下降。
  3. 定量依据：
    • 溶液在517 nm处吸光度的降低程度与所加入的抗氧化剂清除DPPH自由基的能力（即提供氢原子或电子的能力）呈正相关。吸光度下降越多，表明抗氧化剂的自由基清除能力越强。
 

二、 实验材料与试剂

  • 主要试剂：
    • DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)
    • 无水乙醇 或 甲醇 (分析纯，作为溶剂)
    • 待测样品溶液 (需溶解或分散在上述溶剂中，通常配制成不同浓度的溶液)
    • Trolox (水溶性维生素E类似物，常用作阳性对照/标准品)
    • 抗坏血酸 (维生素C，常用作阳性对照)
  • 主要仪器设备：
    • 可见光分光光度计
    • 分析天平
    • 恒温水浴锅 (可选，用于控制反应温度)
    • 移液枪及枪头
    • 容量瓶、棕色试剂瓶（避光贮存DPPH溶液）
    • 具塞试管或比色皿
    • 漩涡混合器或手动振摇
    • 计时器
 

三、 实验步骤详解

  1. DPPH储备液配制：

    • 精确称取适量DPPH粉末，用无水乙醇（或甲醇）溶解。
    • 定容，配制成浓度通常在0.1 - 0.2 mM范围内的储备液（例如，精确称取约3.94 mg DPPH，用乙醇定容至50 mL，得到约0.1 mM溶液）。
    • 关键： DPPH储备液需现用现配或避光冷藏保存（通常不超过3天），使用前需恢复至室温并检查其吸光度稳定性。

  2. 样品溶液配制：

    • 将待测样品（固体需研磨均匀，液体需了解其溶剂）用与DPPH相同的溶剂（乙醇或甲醇）溶解或稀释，配制成一系列不同浓度的测试液。

  3. 反应体系建立：

    • 对照组 (Control)： 取适量溶剂（乙醇/甲醇） + DPPH储备液。例如：2.0 mL 溶剂 + 2.0 mL DPPH储备液。此组吸光度记为 A_control。
    • 样品组 (Sample)： 取不同浓度的待测样品溶液 + DPPH储备液。例如：2.0 mL 样品溶液 + 2.0 mL DPPH储备液。此组吸光度记为 A_sample。
    • 空白组/背景组 (Blank)： 取样品溶液 + 溶剂。例如：2.0 mL 样品溶液 + 2.0 mL 溶剂。此组用于扣除样品自身颜色或溶剂在517 nm处的吸收干扰，吸光度记为 A_blank。
    • 阳性对照组： 用Trolox或抗坏血酸溶液替代样品溶液，按样品组操作进行，用于评估实验体系的有效性及与标准抗氧化剂比较。

  4. 混合与反应：

    • 将各管（或比色皿）中的溶液充分混匀（如涡旋振荡数秒）。
    • 将反应体系置于暗处，室温下避光静置反应一段时间（通常在30 - 60分钟，需根据文献或预实验确定最佳时间，并保持所有组反应时间一致）。
    • 关键： 避光操作至关重要！ 光照可能导致DPPH分解，影响结果准确性。

  5. 吸光度测定：

    • 反应结束后，立即使用可见光分光光度计，在517 nm波长下，以反应溶剂（如乙醇）为参比，分别测定对照组 (A_control)、样品组 (A_sample)、空白组 (A_blank) 的吸光度值。
    • 注意： 需确保比色皿洁净干燥，避免气泡干扰读数。
 

四、 数据处理与结果表达

  1. 计算自由基清除率 (Scavenging Activity/Inhibition Rate, %):

    • 清除率 (%) = [1 - (A_sample - A_blank) / A_control] × 100%
    • 解释：
      • A_control: 纯DPPH溶液的吸光度，代表最大自由基浓度。
      • A_sample - A_blank: 扣除样品自身背景吸收后，反应体系中剩余的DPPH吸光度。
      • (A_sample - A_blank) / A_control: 剩余的DPPH比例。
      • 1 - ...: 被清除的DPPH比例。

  2. 绘制剂量效应曲线：

    • 以样品浓度（横坐标，通常取对数）对其对应的DPPH自由基清除率（纵坐标，%）作图。
    • 该曲线通常呈S型或类线性关系。

  3. 计算半数抑制浓度 (IC50):

    • 定义： 使DPPH自由基清除率达到50%时所需的样品浓度。
    • 方法： 通过剂量效应曲线图，找出清除率为50%时对应的样品浓度值。可使用线性回归（对线性部分）或非线性拟合（常用Logit法或四参数Logistic模型）进行计算。
    • 意义： IC50 是最常用的评价指标，值越小，表明样品的DPPH自由基清除能力越强。

  4. 阳性对照比较：

    • 计算阳性对照（如Trolox）的IC50值。
    • 可以计算样品的抗氧化活性当量（Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, TEAC），即产生与1 μmol Trolox相同清除效果所需的样品量（μmol）。
 

五、 方法优势与特点

  • 操作简便快捷： 实验步骤相对简单，无需复杂仪器（核心是分光光度计）。
  • 稳定性好： DPPH自由基稳定，可在室温下长时间保持活性。
  • 灵敏度高： 颜色变化明显，吸光度变化易于检测。
  • 适用范围广： 可用于纯化合物、植物提取物、食品、药品等多种物质的抗氧化能力初步筛选和比较。
  • 重现性较好： 在严格控制实验条件（浓度、时间、温度、避光）下，结果较为可靠。
 

六、 注意事项与局限性

  1. 溶剂选择：
    • 首选无水乙醇或甲醇。待测样品必须能溶解或稳定分散于该溶剂中。
    • 若样品为水溶性，需确保其在水溶液中的稳定性和与乙醇/甲醇的互溶性，或探索使用混合溶剂（如含少量水的乙醇），但需验证DPPH在该混合溶剂中的稳定性及光谱特性是否改变。
  2. 浓度范围：
    • DPPH工作液浓度需适宜（通常0.04 - 0.1 mM），过低则反应不灵敏，过高则清除率难以达到较高水平。
    • 样品浓度设置需覆盖一定的清除率范围（如5%-95%），特别是围绕50%清除率，以保证IC50计算的准确性。
  3. 反应时间与温度：
    • 明确并统一反应时间至关重要！ 不同抗氧化剂与DPPH反应达到平衡的时间可能不同。需进行动力学实验确定最佳反应时间。
    • 温度会影响反应速率，需在恒定温度（通常室温25°C）下进行实验。
  4. 严格避光： 这是实验成功的关键！ DPPH遇光易分解，所有涉及DPPH溶液的配制、反应和贮存必须在避光条件下进行（使用棕色瓶和避光容器）。
  5. 背景干扰扣除： 样品自身的颜色或溶剂在517 nm处可能有吸收，必须设置样品空白组（A_blank）进行扣除。
  6. 反应特异性：
    • 只能检测能提供氢原子或电子、并能与DPPH发生还原反应的物质。
    • 对某些通过其他机制（如螯合金属离子、抑制自由基生成酶）起作用的抗氧化剂不敏感。
    • 某些有色物质或强还原剂（如硫醇类）可能干扰测定结果。
  7. 局限性：
    • 体外模拟： DPPPH是人工合成的稳定自由基，其反应机制和速率与体内真实的生物自由基（如•OH, O₂•⁻）有差异。实验结果不能直接等同于体内的抗氧化效果。
    • 溶剂限制： 对水溶性极强或仅溶于非极性溶剂的样品存在适用性问题。
    • 单电子转移机制： 主要反映物质通过单电子转移途径清除自由基的能力。
 

七、 应用领域

DPPH法广泛应用于以下领域：

  1. 天然产物研究： 评估植物提取物、精油、酚类、黄酮类、多糖等天然化合物的抗氧化活性。
  2. 食品科学： 评价食品原料、添加剂、功能食品、果汁、油脂、饮料等的抗氧化能力及货架期预测。
  3. 药物开发： 筛选具有抗氧化活性的候选药物分子。
  4. 化妆品： 评估护肤品原料（如维生素、多酚）的抗氧化功效。
  5. 基础研究： 比较不同物质的抗氧化能力，研究结构与活性的关系。
 

结语

DPPH自由基清除法作为一种经典、简便、高效的体外抗氧化活性评价手段，在科研和工业领域发挥着重要作用。理解其原理、熟练掌握操作细节（特别是避光要求）、正确进行数据处理并认识其局限性，是获得可靠、可比实验结果的关键。它通常是抗氧化研究的第一步，常与其他体外方法（如ABTS⁺法、FRAP法、ORAC法）和细胞/动物模型实验相结合，以更全面地评价物质的抗氧化特性。

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