绝对荧光定量

发布时间：2025-06-14 09:29:13 阅读量：5 作者：生物检测中心

绝对荧光定量 PCR（qPCR）：精准定量的金标准

绝对荧光定量 PCR（Quantitative Real-Time PCR, qPCR），是一种革命性的分子生物学技术。它不仅能检测目标核酸序列（DNA 或 cDNA）的存在，更能精确测定样本中该序列的绝对初始拷贝数。这一特性使其成为生命科学研究和临床诊断中不可或缺的精密工具。

一、核心原理：实时监测与循环阈值（Ct）

与终点法 PCR 不同，qPCR 在每一次 PCR 循环的延伸阶段实时采集荧光信号。其核心原理基于：

  1. 荧光报告系统： 实验中使用的荧光染料（如 SYBR Green I）或特异性荧光探针（如水解探针、分子信标等）在 PCR 过程中与扩增产物结合或水解，释放出荧光信号。扩增产物数量与荧光强度成正比。
  2. 阈值设定与 Ct 值： 仪器软件设定一个显著高于背景噪音的荧光信号阈值线。当 PCR 产物的荧光强度首次跨越此阈值时，所对应的 PCR 循环数即为 Ct 值（Threshold Cycle）。荧光信号达到阈值意味着目标序列的扩增进入指数增长期。

二、“绝对”定量的关键：标准曲线法

绝对定量的核心在于建立目标序列的拷贝数与 Ct 值之间的定量关系，这通过标准曲线实现：

  1. 标准品制备： 制备一系列已知绝对拷贝数的标准品。通常使用：
    • 体外转录的 RNA： 适用于 RNA 定量（需先反转录为 cDNA）。
    • 克隆到质粒载体中的目标 DNA 片段： 适用于 DNA 定量。通过精确测定质粒浓度和分子量，计算出每微升溶液中包含的目标 DNA 拷贝数。
    • 合成的双链 DNA 片段（gBlocks）： 长度更精确，背景更纯净。
  2. 梯度稀释： 将已知浓度的标准品进行一系列（通常 5-10 倍）的对数梯度稀释（如 10^8, 10^7, 10^6, 10^5, 10^4 copies/μL）。
  3. 同步扩增： 将稀释好的标准品梯度与待测样本在同一块反应板上，使用完全相同的试剂、引物/探针和扩增程序进行 qPCR 反应。
  4. 绘制标准曲线： 以每个标准品浓度的对数（log10[起始拷贝数]）为横坐标（X 轴），以其对应的平均 Ct 值为纵坐标（Y 轴），绘制散点图并进行线性回归分析，得到一条 Ct = k * log10(起始拷贝数) + b 的标准曲线。该曲线的斜率（k） 反映了扩增效率（理想值约为 -3.32，对应 100% 效率），截距（b） 与检测灵敏度相关，相关系数（R²） 应接近 1（通常 >0.99），表示线性关系良好。
  5. 计算未知样本： 将待测样本的 Ct 值代入标准曲线方程（X = (Ct - b) / k），即可计算出该样本中目标序列的绝对起始拷贝数的对数，再通过取反对数（10^X），得到具体的绝对拷贝数（通常表示为 copies/μL 反应体系或 copies/μg 总 RNA/DNA 等）。

三、绝对定量的核心优势

  1. 真正的精确量化： 直接报告目标分子的具体拷贝数，而非相对比例。
  2. 结果标准化与可比性： 结果不依赖于内参基因（尽管内参可用于评估样本质量和反应效率），不同实验室、不同批次实验的结果理论上可以直接比较。
  3. 临界值设定明确（临床应用）： 在病原体检测（如病毒载量 HBV/HIV）中，可直接设定具有临床意义的拷贝数阈值（copies/mL）用于诊断、预后判断和治疗监测。
  4. 分子诊断标准： 是许多传染病、遗传病分子诊断和疗效评估的金标准或核心依据。

四、关键应用场景

  1. 病原体载量检测： 精确测定患者血液、组织中病毒（如 HIV, HBV, HCV, SARS-CoV-2）、细菌、寄生虫等的数量，指导治疗和评估疗效。
  2. 转基因成分定量： 准确测定食品、饲料、环境样品中转基因（GMO）成分的拷贝数或百分比含量，满足法规要求。
  3. 基因拷贝数变异分析： 检测基因组中特定基因位点的拷贝数增加（扩增）或减少（缺失），用于癌症研究、遗传病诊断。
  4. 标准物质定值： 为核酸标准物质提供精确的绝对浓度赋值。
  5. 病毒载体滴度测定： 在基因治疗和疫苗研发中，精确测定重组病毒载体（如腺病毒、慢病毒）的基因组拷贝滴度（GC/mL）。
  6. 核酸标准品/参考品的精确制备与验证。

五、技术要点与挑战

  1. 标准品质量至关重要： 标准品的浓度必须绝对准确，其扩增效率必须与待测样本中的目标序列高度一致。纯度、稳定性、无抑制剂是关键。标准品的基质应尽量模拟样本。
  2. 极高的实验精度： 移液操作、试剂均一性、仪器校准等因素对结果的准确性影响巨大，需要极其严谨的实验操作规范（SOP）和熟练的技术人员。建议使用高质量的移液器并进行定期校准。
  3. 验证扩增特异性： 熔解曲线分析（针对染料法）或探针特异性验证必不可少，以确保检测信号仅来源于目标产物。
  4. 验证扩增效率： 标准曲线的斜率应在 -3.1 到 -3.6 之间（对应 90%-110% 效率）。待测样本的扩增效率应尽可能接近标准品。
  5. 动态范围： 标准曲线覆盖的浓度范围（通常跨越 6-8 个数量级）必须包含预期样本的浓度范围。
  6. 抑制物的影响： 样本中存在的抑制剂会降低 PCR 效率，低估目标拷贝数。可通过样本稀释、加入校正因子（SPIKE）或使用耐抑制酶的试剂盒来缓解。

小结：

绝对荧光定量 PCR 凭借其强大的精准定量能力，成为生命科学和医学诊断领域量化核酸的金标准方法。其核心在于利用已知绝对拷贝数的标准品建立可靠的线性标准曲线，通过待测样本的 Ct 值反推出其初始模板的绝对数量。虽然对实验操作、标准品质量和验证要求极为严格，但在需要提供明确拷贝数结果的场景（如病原体载量、转基因定量、拷贝数变异分析、标准品定值等），绝对定量 qPCR 是不可替代的强大工具。理解其原理并严格把控实验流程是获得可靠、可比数据的基石。