相对荧光定量

发布时间：2025-06-14 09:27:16 阅读量：3 作者：生物检测中心

相对荧光定量PCR：原理、流程与应用

一、引言

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR, qPCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过对反应体系中荧光信号的实时检测来定量起始模板数量的技术。其中，“相对荧光定量”是qPCR最核心和最广泛的应用之一，主要用于测定目标基因在不同样本（如不同处理组、不同组织、不同时间点）之间的表达量差异，而无需知道其绝对拷贝数。

二、 核心原理：Ct值与相对定量

  1. 荧光信号与扩增： PCR扩增过程中，随着目标DNA片段呈指数级增长，与之结合的荧光染料（如SYBR Green I）或荧光标记的特异性探针（如TaqMan探针）所释放的荧光信号强度也随之增加。
  2. Ct值（阈值循环数 Threshold Cycle）： 这是qPCR定量的基石。Ct值是指PCR扩增过程中，样品的荧光信号强度达到预先设定的检测阈值时所经历的循环数。Ct值与起始模板量成反比： 起始模板量越高，达到阈值所需的循环数越少，Ct值越小；反之，起始模板量越低，Ct值越大。
  3. 相对定量的核心思想： 相对定量不关心目标基因的绝对拷贝数，而是关注它在实验组（Treatment Group） 相对于对照组（Control Group或参考组） 的表达变化倍数（Fold Change）。为了消除样本间在RNA提取质量、逆转录效率及加样误差等非目标因素引起的差异，必须引入内参基因（Reference Gene/Housekeeping Gene）。

三、 关键概念：内参基因

  • 定义： 内参基因是在不同样本、不同处理条件下表达水平保持相对恒定的基因。
  • 作用：
    • 标准化（Normalization）： 校正样本间非目标基因表达差异造成的误差（如RNA起始量、逆转录效率、加样体积差异）。
    • 提供比较基准： 将目标基因的表达量相对于内参基因的表达量进行比较（ΔCt），使得不同样本间目标基因的表达水平具有可比性。
  • 选择标准： 内参基因的选择至关重要。理想的内参基因应在所有实验条件下表达稳定。常用的内参基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA等，但需通过实验验证其在特定实验体系中的稳定性（可使用geNorm、NormFinder等软件评估）。

四、 相对定量实验流程

  1. 实验设计：
    • 明确实验组和对照组。
    • 确定目标基因和内参基因（通常需要多个候选内参并进行稳定性验证）。
    • 严谨设置生物学重复和技术重复（通常建议≥3个生物学重复，技术重复可设2-3次）。
  2. 样本准备：
    • 提取总RNA（确保高质量RNA：OD260/280≈2.0，RIN值>7）。
    • RNA逆转录成cDNA（使用高质量逆转录酶，注意去除基因组DNA污染）。
  3. 引物设计：
    • 针对目标基因和内参基因设计特异性引物（长度18-22bp，Tm值58-60℃，GC含量40-60%）。
    • 进行特异性验证（通过常规PCR或熔解曲线分析）和效率验证（制备标准曲线，PCR效率应在90%-110%之间）。
  4. qPCR反应：
    • 反应体系包含：cDNA模板、特异性引物（目标基因和内参基因）、qPCR预混液（包含DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、荧光染料或探针所需的组分）、无核酸酶水。
    • 在实时荧光定量PCR仪上运行程序：通常包括预变性（激活酶）、变性、退火、延伸并采集荧光信号（40-45个循环）。
  5. 熔解曲线分析（仅对染料法如SYBR Green I必需）：
    • PCR结束后进行温度梯度升温（如65°C到95°C），监测荧光信号变化。
    • 生成熔解曲线。特异性的扩增产物会产生单一的峰；出现杂峰或宽峰提示存在引物二聚体或非特异性扩增。

五、 数据分析：经典的2^(-ΔΔCt)法

这是最常用且直观的相对定量计算方法：

  1. 计算ΔCt： 对每个样本（包括实验组和对照组）：
    • ΔCt = Ct(目标基因) - Ct(内参基因)
    • 此步骤已利用内参基因对目标基因的Ct值进行了标准化，消除了样本间差异。
  2. 计算ΔΔCt： 选择一个对照组作为校准样本（Calibrator）。通常，对照组样品的ΔCt平均值作为参考基准。
    • ΔΔCt = ΔCt(实验组样本) - ΔCt(对照组平均值)
    • ΔΔCt代表实验组相对于对照组，经过内参基因校正后的目标基因表达差异。
  3. 计算表达变化倍数（Fold Change, FC）：
    • FC = 2^(-ΔΔCt) （适用于扩增效率接近100%的理想情况）。
    • 如果PCR效率（E）不是100%，则公式需修正为：FC = (1 + E)^(-ΔΔCt) （E需通过标准曲线计算得出）。
  4. 结果解读：
    • FC > 1：表示实验组目标基因表达量相对于对照组上调（Up-regulated），数值即为上调的倍数（如FC=3.2，表示上调3.2倍）。
    • FC < 1：表示实验组目标基因表达量相对于对照组下调（Down-regulated），其倒数（1/FC）即下调的倍数（如FC=0.25，表示下调了4倍）。
    • FC ≈ 1：表示表达量无明显差异。

六、 应用领域

相对荧光定量PCR因其高灵敏度、高特异性、高通量、定量范围宽等特点，被广泛应用于生命科学研究的各个领域：

  1. 基因表达差异分析： 研究不同组织、不同发育阶段、不同病理状态（疾病vs健康）、不同环境刺激（药物处理、激素处理、胁迫处理等）下特定基因（mRNA）的表达水平变化。这是其最核心的应用。
  2. microRNA (miRNA) 表达分析： 需要特殊的茎环引物或加尾法进行逆转录和检测。
  3. 转基因生物检测： 检测外源基因在转基因生物中的表达水平。
  4. 病原体检测与分型（相对定量应用较少，更多是绝对定量）： 某些情况下也需要评估病原体载量的相对变化。
  5. 基因多态性研究与SNP分型（需配合特异性探针）： 如等位基因特异性表达分析（需要区分等位基因的表达差异）。

七、 质量控制与注意事项

  1. 严格遵守操作规程： 从RNA提取到数据分析，每一步都需严谨操作，避免核酸酶污染和交叉污染。
  2. RNA质量至关重要： 起始RNA的质量直接影响结果的可靠性。
  3. 引物特异性与效率验证： 引物设计不当或未经验证是错误结果的常见来源。熔解曲线单峰和效率在90%-110%之间是基本要求。
  4. 内参基因的稳定性验证： 这是相对定量准确性的关键前提。切勿假设某个常用内参基因在所有条件下都稳定。
  5. 设置合理的重复： 充分的生物学重复（反映生物个体差异）和技术重复（反映实验操作误差）是获得可靠统计结果的保障。
  6. 标准曲线的使用（用于效率计算）： 虽然不是相对定量计算的直接步骤，但对评估PCR效率至关重要。
  7. 数据分析方法选择： 2^(-ΔΔCt)法是最常用且直观的，但在某些复杂实验设计（如多因素）或内参基因效率不一致时，可采用其他计算方法（如比较Ct法配合效率校正、或结合专用软件）。

八、 结论

相对荧光定量PCR是研究基因表达差异不可或缺的强大工具。通过精确测定Ct值，引入稳定表达的内参基因进行标准化，并运用2^(-ΔΔCt)等计算方法，研究者能够准确、灵敏地定量目标基因在不同生物学样本或处理条件下的相对表达变化。深入理解其原理、严格把控实验流程（尤其是RNA质量、引物验证、内参选择）和数据分析方法，是获得可靠和有生物学意义的实验结果的关键。该技术将继续在基因功能研究、疾病机理探索、药物开发、分子诊断等领域发挥核心作用。