脂联素受体AdipoR1/R2表达检测

发布时间：2026-04-16 阅读量：9 作者：生物检测中心

脂联素受体AdipoR1与AdipoR2表达检测：方法与意义

一、 脂联素受体概述

脂联素（Adiponectin）是一种主要由脂肪细胞分泌的重要脂肪因子，在调节葡萄糖稳态、脂肪酸氧化和胰岛素敏感性等方面发挥核心作用。其生理效应主要通过两种七次跨膜受体介导：

  • AdipoR1： 主要在骨骼肌中高表达，对球型脂联素亲和力更高，激活AMPK信号通路。
  • AdipoR2： 主要在肝脏中高表达，对全长脂联素亲和力更高，激活PPAR-α信号通路。
 

AdipoR1/R2的表达水平及其功能状态与肥胖、2型糖尿病、代谢综合征、心血管疾病、非酒精性脂肪肝等多种代谢性疾病密切相关。准确检测其表达变化是研究其生理病理功能、药物作用靶点及潜在诊断标志物的基础。

二、 样本准备

检测AdipoR1/R2表达的首要步骤是获取并妥善处理样本：

  1. 细胞样本：
    • 收集贴壁或悬浮细胞，使用适宜的裂解液（如含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液）裂解细胞，提取总蛋白或RNA。
    • 用于免疫荧光/免疫组化的细胞需固定（如多聚甲醛）并通透处理。
  2. 组织样本：
    • 新鲜组织：快速分离目标组织（如肌肉、肝脏、脂肪），液氮速冻后存于-80°C，或立即放入裂解液/RNA保存液中匀浆处理。用于冰冻切片的组织需OCT包埋速冻。
    • 石蜡包埋组织：可用于免疫组化。
  3. 体液样本：
    • 血浆/血清中的可溶性AdipoR水平也可作为指标，常用ELISA法检测（非直接检测细胞膜受体表达）。
 

三、 主要检测方法

  1. 蛋白质水平检测：

    • Western Blotting (蛋白免疫印迹)：
      • 原理： 通过SDS-PAGE电泳分离组织/细胞裂解液中的蛋白质，转膜后利用特异性的抗AdipoR1或抗AdipoR2抗体进行杂交，最后通过化学发光或显色方法检测目标蛋白条带。
      • 关键步骤: 蛋白定量、上样量均一化、选择合适的分离胶浓度、有效的转膜、封闭（常用5%脱脂奶粉或BSA）、一抗/二抗浓度优化与孵育时间温度控制、充分的洗涤（常用TBS-T）。
      • 优点： 相对定量可靠，可直观显示蛋白大小和表达量，特异性较好。
      • 缺点： 操作步骤多、耗时长，通量较低，半定量。
    • 免疫组织化学 (Immunohistochemistry, IHC) / 免疫细胞化学 (Immunocytochemistry, ICC)：
      • 原理： 在组织切片或细胞爬片上，利用特异性抗体结合AdipoR1/R2，通过显色反应（如DAB）或荧光标记，在显微镜下观察受体在细胞或组织中的定位（膜定位为主）和相对表达丰度。
      • 关键步骤: 抗原修复（尤其是石蜡切片）、有效的封闭、抗体浓度和孵育条件优化、避免非特异性染色、设置阳性和阴性对照。
      • 优点： 提供空间定位信息（细胞膜、胞浆），直观显示组织分布异质性。
      • 缺点: 定量相对困难（需借助图像分析软件），结果解读受主观因素影响。
    • 流式细胞术 (Flow Cytometry)：
      • 原理： 主要用于悬浮细胞或经消化的实体组织单细胞悬液。用荧光标记的特异性抗体染色细胞表面的AdipoR1/R2，通过流式细胞仪检测荧光强度，分析特定细胞群中受体的表达水平和阳性细胞比例。
      • 关键步骤： 制备高质量的单细胞悬液、优化抗体染色浓度和条件（注意避光）、设置同型对照/FMO对照。
      • 优点： 可对混合细胞群体中的特定细胞进行定量分析，通量高，统计性强。
      • 缺点： 需要制备单细胞悬液，对组织样本可能造成细胞损失或活性下降，无法提供亚细胞定位信息。

  2. mRNA水平检测：

    • 实时荧光定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)：
      • 原理： 提取组织或细胞总RNA，逆转录成cDNA，利用针对AdipoR1或AdipoR2 mRNA设计的特异性引物，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。通过监测荧光信号（如SYBR Green或探针法）达到设定阈值所需的循环数（Ct值），相对定量样本中目标mRNA的丰度。
      • 关键步骤: RNA提取质量（纯度、完整性，OD260/280比值）、有效的DNA酶消化、逆转录效率、引物特异性与效率验证、选择合适的内参基因（如GAPDH、β-actin等，需验证其在实验条件下表达稳定）。
      • 优点： 灵敏度高、特异性强、通量较高、可相对定量。
      • 缺点： 检测的是mRNA水平，不一定完全反映功能性蛋白的水平（存在转录后调控）。
 

四、 结果分析与注意事项

  1. 定量方法：
    • Western Blot: 通过成像系统扫描条带，利用图像分析软件测量目标条带和内参条带（如β-actin, GAPDH）的灰度值，计算目标蛋白/内参蛋白的比值进行相对定量。
    • IHC/ICC: 使用图像分析软件对染色强度（平均光密度）和阳性染色面积进行定量分析，或采用半定量评分法（如H-score）。
    • 流式细胞术： 直接获取平均荧光强度（MFI）或阳性细胞百分比数据。
    • qRT-PCR: 采用ΔΔCt法计算目标基因相对于内参基因及对照组的相对表达量变化（Fold change）。
  2. 设置对照：
    • 阳性对照： 已知表达AdipoR1/R2的细胞或组织样本（如骨骼肌用于AdipoR1，肝脏用于AdipoR2）。
    • 阴性对照：
      • 实验阴性对照： 不表达该受体的细胞/组织（有时难以获得）。
      • 方法阴性对照： 空白试剂对照（Blank）、无模板对照（NTC用于qPCR）、无抗体/IgG同型对照抗体（用于WB/IHC/ICC/流式）。
    • 内参对照： 用于校正上样量差异（WB中的管家蛋白）或RNA/cDNA的量与质量（qPCR中的管家基因）。
  3. 抗体选择与验证： 至关重要！需选择经过特异性验证（如Knockdown/Knockout验证、多种方法交叉验证）的高质量抗体。注意抗体的种属反应性、适用方法（WB/IHC/IF/流式）及推荐的稀释比例。
  4. 重复性： 所有实验均需设置生物学重复（不同样本）和技术重复（同一样本多次检测），以保证结果的可靠性和统计效力。
  5. 标准化： 确保样本处理、实验操作条件尽可能一致，以减小误差。
 

五、 应用与意义

精确检测AdipoR1/R2的表达具有重要价值：

  1. 基础研究： 阐明脂联素信号通路的调控机制，研究其在代谢、炎症、衰老、癌症等生理病理过程中的作用；探究基因敲除/过表达、药物处理、环境因素等对受体表达的影响。
  2. 疾病机制研究： 揭示AdipoR1/R2表达异常（下调或上调）与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化、脂肪肝等疾病发生发展的关联，寻找潜在的病理标志物。
  3. 药物研发与评价： 筛选能够调节AdipoR1/R2表达或激活其信号通路的新型药物（如AdipoR激动剂），评价药物作用靶点与疗效。
  4. 临床潜在应用： 血清可溶性AdipoR水平作为代谢疾病状态的潜在生物标志物正在研究中。
 

六、 总结

检测AdipoR1/R2的表达是深入研究脂联素生物学功能及其在代谢性疾病中作用的关键环节。研究者应根据具体的研究目的和样本类型（蛋白或mRNA水平、定位需求、通量要求等），选择最适合的检测方法（Western Blotting, qRT-PCR, IHC/ICC, 流式细胞术等），并严格遵循标准化的操作流程，特别注重高质量抗体的选择与验证、严谨的实验设计（设置有效的对照、足够的重复）以及规范的结果分析。这些对于获得可靠、可重复的数据至关重要，将为理解脂联素受体的功能和相关疾病的防治提供坚实的基础。

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