脂质过氧化物共轭双烯检测（紫外分光光度法）
一、 原理
脂质过氧化是自由基攻击多不饱和脂肪酸（PUFA）引发的链式反应。其早期关键步骤是PUFA脱去双键间的亚甲基氢，形成烷基自由基（L•），进而与氧分子结合生成过氧自由基（LOO•）。LOO•夺取另一PUFA的氢，形成脂质氢过氧化物（LOOH）和新的L•，使反应持续。
在此过程中，多不饱和脂肪酸的双键结构发生重排，形成具有共轭双烯（Conjugated Dienes, CD） 结构的化合物。共轭双烯体系（-C=C-C=C-）具有独特的紫外吸收特性，其最大吸收峰位于234 nm附近（通常在230-235 nm范围），摩尔消光系数显著增加（约为2.5 × 10⁴ L·mol⁻¹·cm⁻¹）。未被氧化的多不饱和脂肪酸（孤立双键）在此波长下吸收很弱。
因此，通过检测样本在234 nm处的吸光度增量（与未氧化对照相比），即可定量评估样品中脂质过氧化早期产物的相对含量，即共轭双烯值（Conjugated Diene Value）。
二、 材料与仪器
- 样品： 待测脂质样品（如血浆、血清、组织匀浆上清液、低密度脂蛋白LDL、纯化油脂等）。
- 有机溶剂： 高纯度（光谱级或HPLC级）环己烷、正己烷或异辛烷。氯仿-甲醇混合液（2:1, v/v）（用于含组织或生物样本的脂质提取）。
- 空白对照溶剂： 与溶解/稀释样品相同的有机溶剂。
- 仪器：
- 紫外-可见分光光度计
- 石英比色杯（1 cm光径，常用）
- 精密移液器及枪头
- 涡旋振荡器
- 离心机（用于含组织样本的前处理）
- 氮气吹扫装置（可选，用于防止氧化）
- 玻璃试管（具塞）
三、 实验步骤（以纯化油脂或LDL为例）
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样品制备：
- 纯脂质/油脂： 准确称量适量样品（通常数毫克至数十毫克），用选定的有机溶剂（如环己烷或正己烷）溶解并定容至一定体积（如5-10 mL），使溶液浓度合适（吸光度在仪器线性范围内，通常目标A234在0.2-1.0之间为宜）。轻微振荡或涡旋混匀。如有不溶物，离心取上清。
- 生物样本（如血浆、血清、LDL溶液、组织匀浆上清液）：
- 取一定体积样品（如血浆100-200 μL）加入玻璃试管。
- 加入氯仿-甲醇混合液（2:1, v/v，体积通常为样品体积的10-20倍，如2-4 mL）。
- 涡旋振荡1-2分钟，充分萃取脂质。
- 离心（如3000 rpm, 10分钟）使两相分离。
- 小心吸取下层（氯仿层，含脂质）至另一干净试管。
- 可重复萃取一次，合并下层。
- （关键除杂步骤） 用与氯仿等体积的0.9% NaCl溶液（或纯水）洗涤氯仿提取液1-2次。每次加入盐水后，涡旋混匀，离心分层，弃去上层水相。
- 将洗涤后的氯仿层转移至新试管。
- 在通风橱中，用温和氮气流吹干氯仿（温度不超过40℃），避免过度加热导致氧化。
- 立即用选定的有机溶剂（环己烷或正己烷）溶解干燥的脂质残留物，并定容至一定体积（如1-2 mL），混匀备用。
- 制备空白对照管：使用与溶解样品完全相同的溶剂体系（如环己烷或正己烷），不含任何样品脂质。
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紫外扫描测定：
- 开启紫外分光光度计，预热。
- 设置扫描参数：
- 波长范围：通常220 nm 至 300 nm（重点观察234 nm附近）。
- 扫描速度：中速。
- 狭缝宽度：1-2 nm（确保足够分辨率）。
- 用空白对照溶剂彻底清洗石英比色杯，并用空白对照溶液润洗数次。
- 将空白对照溶液注入比色杯，放入样品池，进行基线扫描或调零（在234 nm处）。
- 取出空白杯，倒掉溶液。
- 用待测样品溶液润洗比色杯数次。
- 注入待测样品溶液，放入样品池。
- 执行光谱扫描，记录200-300 nm范围内的吸收光谱。
- 定位234 nm处的最大吸光度值（A234）。基线位置通常选取光谱中无明显吸收的平坦区域（如250-300 nm范围内选择一个点如260 nm或270 nm，或采用切线法）。
- 记录样品在234 nm处的吸光度值（A234样品）。
- （可选）对每个样品进行平行测定（n≥2）。
四、 结果计算
共轭双烯值（CD值）通常以两种形式表示：
-
吸光度差值（ΔA234）：
- 这是最直接的表示方法。
ΔA234 = A234样品 - A234空白- 空白通常是纯溶剂在234 nm的吸光度。
-
毫摩尔消光系数（ϵ）：
- 计算结果需要知道样品中脂质的浓度（通常基于所含脂质的总量，常用磷脂磷含量或总胆固醇含量来衡量）。
ϵ (L·mol⁻¹·cm⁻¹) = (ΔA234) / (c * l)ΔA234：样品在234 nm处的吸光度（已扣除空白）。c：样品中脂质的摩尔浓度（mol/L）。注意： 这里的浓度是脂质中容易被氧化的底物（通常是PUFA）的浓度。实际操作中常简化为以样品中总磷脂浓度（通过测定磷脂磷换算）或总胆固醇浓度（对于LDL）作为c。对于纯油脂，可用总脂质摩尔浓度。l：比色杯光径（cm，通常为1 cm）。
- CD值常表示为
ϵ × 10⁻³ (L·mmol⁻¹·cm⁻¹)以适应生物样本浓度。
示例报告： 血浆脂质提取物的共轭双烯值（CD值）为 ΔA234 = 0.125 ± 0.010 （或基于磷脂磷浓度计算得 ϵ = 22,500 L·mol⁻¹·cm⁻¹）。
五、 注意事项
- 溶剂纯度： 必须使用高纯度溶剂（光谱级或HPLC级），普通溶剂在紫外区（尤其短波长）常有杂质干扰，导致高背景和假阳性。
- 石英比色杯： 必须使用石英比色杯，普通玻璃比色杯在紫外区（尤其<300 nm）吸收强烈。
- 样品浓度： 样品浓度过高（A234 > 1.2）易超出仪器线性范围并引起光散射误差。浓度过低则信号弱，误差大。需通过预实验优化样品用量或稀释倍数。
- 避免氧化： 整个操作过程（尤其脂质提取、溶解、转移）应尽量快速，避免光照（尤其是紫外光），在惰性气体（如氮气）保护下操作更佳。使用棕色玻璃器皿或避光操作。试剂瓶盖紧。
- 温度控制： 吸光度受温度影响。室温波动大时，应考虑使用恒温比色支架。标准操作应在恒定温度（如25°C）下进行并注明。
- 水/杂质去除： 对于生物样本脂质提取物，必须充分洗涤去除水溶性杂质（如蛋白质、盐、水溶性维生素），这些杂质在紫外区可能有吸收或引起浊度干扰。确保最终用于测定的有机溶液澄清透明，无浑浊（否则会产生光散射，导致假性高吸收）。如有浑浊需过滤或再次离心。
- 基线校正： 正确设定基线至关重要。样品溶液在250-300 nm区域的吸光度应非常低且平坦。若该区域有明显抬升，可能提示存在非特异性吸收或浊度干扰（如样品不纯、有微粒），需重新处理样品。
- 稳定性： 制备好的样品溶液应尽快测定，避免放置过程中继续氧化或溶剂挥发导致浓度变化。
六、 优缺点
- 优点：
- 原理清晰，直接反映脂质过氧化早期的关键理化变化（共轭双烯结构形成）。
- 操作相对简便、快速。
- 成本较低（主要仪器为紫外分光光度计）。
- 灵敏度尚可（摩尔消光系数较高）。
- 缺点：
- 特异性有限：其他非脂质过氧化来源的共轭双烯化合物（如胆红素、某些药物代谢物、提取过程中引入的杂质）也可能在234 nm有吸收，导致假阳性。生物样本背景吸收复杂。
- 主要反映早期氧化产物（共轭二烯氢过氧化物），对次级氧化产物（如醛类）不敏感。
- 受样品浊度影响大（光散射）。
- 对样品纯度要求高（尤其溶剂和脂质提取）。
- 生物样本中脂质组成复杂，计算精确摩尔消光系数较困难（常用总磷脂或总胆固醇浓度近似）。
- 无法区分不同脂质分子氧化的特异性。
七、 应用意义
共轭双烯检测是评估脂质过氧化早期程度的经典、常用指标。它在以下领域有广泛应用：
- 食品科学： 评估食用油、含油食品、饲料的氧化稳定性和新鲜度。
- 生物医学研究：
- 研究氧化应激在疾病（如动脉粥样硬化、神经退行性疾病、糖尿病并发症、炎症、衰老）中的作用机制。
- 评价药物、营养素（如抗氧化剂维生素E、多酚）对脂质过氧化的抑制效果。
- 体外模型（如铜离子诱导LDL氧化）研究脂质氧化动力学。
- 化妆品/日化： 评价含脂质原料或产品的氧化稳定性。
八、 结论
紫外分光光度法检测脂质过氧化物共轭双烯（CD值）是一种基于脂质氧化早期特征结构变化的经典方法。它操作相对简便，能灵敏地指示脂质过氧化的起始阶段，广泛应用于食品、生物医学和化工领域。然而，其特异性受限于生物样本的背景干扰和非特异性吸收，对样品纯度和操作规范要求较高。实际应用中，常需与其他脂质过氧化检测方法（如硫代巴比妥酸反应物TBARS、脂质氢过氧化物化学发光法或FOX法、乙烷/戊烷呼气试验、F2-异前列腺素测定等）联合使用，以获得更全面可靠的氧化应激评估结果。
