总抗氧化能力FRAP法检测

发布时间：2026-04-16 阅读量：20 作者：生物检测中心

FRAP法测定总抗氧化能力：原理与操作详解

一、 基本原理

铁离子还原/抗氧化能力测定法（Ferric Reducing Ability of Plasma），简称FRAP法，是一种简便、快速、稳定且重现性好的体外总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity, TAC）测定方法。其核心原理基于抗氧化剂能够将氧化态的Fe³⁺（三价铁）还原为Fe²⁺（二价铁）。

FRAP试剂的主要成分是：

  • TPTZ (2,4,6-Tripyridyl-s-triazine)： 在酸性条件下，能与Fe²⁺形成稳定的蓝色络合物。
  • FeCl₃·6H₂O (三氯化铁)： 提供Fe³⁺离子。
  • 醋酸盐缓冲液 (pH 3.6)： 提供稳定的酸性反应环境（该pH值下还原反应速率快且干扰少）。
 

当含有抗氧化物质的样品加入到FRAP试剂中时，样品中的抗氧化剂（电子供体）将Fe³⁺-TPTZ络合物中的Fe³⁺还原为Fe²⁺，生成蓝色的Fe²⁺-TPTZ络合物。该蓝色络合物在593 nm波长处具有强吸收峰。蓝色的强度（即593 nm处的吸光度值）与样品中被还原的Fe²⁺量成正比，进而反映了样品中具有还原能力的抗氧化物质的总量。

二、 所需试剂与材料

  • 醋酸盐缓冲液 (300 mmol/L, pH 3.6): 溶解3.1g无水醋酸钠于约500mL蒸馏水中，加入16mL冰醋酸，用蒸馏水定容至1000mL，混匀后调整pH至3.6。
  • TPTZ溶液 (10 mmol/L): 溶解0.031g TPTZ于10mL 40 mmol/L HCl中（需加热助溶）。
  • FeCl₃·6H₂O溶液 (20 mmol/L): 溶解0.054g FeCl₃·6H₂O于10mL蒸馏水中。
  • FRAP工作液 (临用前配制)： 按以下比例混合：醋酸盐缓冲液（pH 3.6） : TPTZ溶液 : FeCl₃·6H₂O溶液 = 10 : 1 : 1（体积比）。例如，取10mL醋酸盐缓冲液，加入1mL TPTZ溶液和1mL FeCl₃·6H₂O溶液，充分混匀。此混合液呈浅黄色或橙色。
  • 标准品储备液 (如抗坏血酸、维生素E或FeSO₄·7H₂O)：
    • 常用FeSO₄·7H₂O（分子量278.05）作为标准品：精确称取约0.0278g FeSO₄·7H₂O，用蒸馏水溶解并定容至100mL，得到1.0 mmol/L Fe²⁺储备液。
    • 或用抗坏血酸标准品。
  • 标准曲线工作液： 用蒸馏水或适当的溶剂（视乎样品）稀释标准品储备液，配制一系列浓度梯度（如0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L Fe²⁺或抗坏血酸当量）。
  • 待测样品： 需根据样品性质（如血浆、血清、组织匀浆、植物提取物、食品、饮料等）进行适当的前处理（稀释、离心、去蛋白等），确保样品处于合适的浓度范围且干扰物质少。
  • 仪器：
    • 可见分光光度计或酶标仪（配备593 nm滤光片）。
    • 恒温水浴箱（37°C）。
    • 精密移液器及枪头。
    • 石英比色皿或96孔微孔板。
    • 计时器。
    • 试管/离心管。
 

三、 操作步骤（以分光光度计比色皿法为例）

  1. 标准曲线的制备：

    • 取数支试管，分别加入不同浓度的标准曲线工作液（如0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）各X µL (例如20 µL或30 µL)。
    • 设一管蒸馏水（X µL）作为空白（0 mmol/L）。
    • 向每支试管中加入预先在37°C预热好的FRAP工作液Y mL (例如1.8 mL或2.97 mL，需确保最终反应体系总体积恒定，通常3 mL)。
    • 立即充分混匀。
    • 置于37°C水浴或恒温环境中，精确反应4分钟。
    • 迅速取出，倒入比色皿中，在593 nm波长下测定各管的吸光度值（A<sub>标准</sub>）。以蒸馏水管调零（或以FRAP工作液调零，需保持一致）。

  2. 样品测定：

    • 取一支试管，加入处理好的待测样品X µL（体积需与标准品加入体积相同）。
    • 加入预热至37°C的FRAP工作液Y mL（体积与标准曲线管相同）。
    • 立即充分混匀。
    • 置于37°C水浴或恒温环境中，精确反应4分钟。
    • 迅速取出，倒入比色皿中，在593 nm波长下测定吸光度值（A<sub>样品</sub>）。调零方式与标准曲线一致。
    • （可选：设置样品空白管，通常用溶解样品的溶剂代替样品，加入FRAP工作液，测定其吸光度A<sub>样品空白</sub>。若A<sub>样品空白</sub>显著高于FRAP工作液本身空白，则需在计算时扣除A<sub>样品空白</sub>）。
     

    注：若使用酶标仪在96孔板中进行测定，需按比例缩小反应体积（如样品10 μL + FRAP工作液290 μL），并确保混合均匀。反应时间、温度、波长不变。

 

四、 结果计算

  1. 绘制标准曲线： 以标准品的浓度（mmol/L Fe²⁺或mmol/L抗坏血酸当量）为横坐标（X），相应的吸光度值（A<sub>标准</sub>）为纵坐标（Y），绘制标准曲线。通常得到一条通过原点（或接近原点）的直线，拟合线性回归方程：Y = aX + b（其中a为斜率，b为截距，理想情况下b应接近于0）。

  2. 计算样品抗氧化能力（FRAP值）：

    • 将测得的样品吸光度值（A<sub>样品</sub>）代入标准曲线的线性回归方程。
    • 解方程得到对应的浓度值（C<sub>样品</sub>，单位：mmol/L Fe²⁺当量或抗坏血酸当量）。
    • 如果样品在测定前经过了稀释（Dilution Factor, DF），则需要乘以稀释倍数。
    • 最终结果表述：
      • 液体样品（如血清、果汁）： FRAP值 = C<sub>样品</sub> × DF （单位：mmol/L Fe²⁺当量）
      • 固体样品（如组织、食品粉末）： FRAP值 = (C<sub>样品</sub> × V<sub>样品提取液</sub> × DF) / W<sub>样品重量</sub> （单位：μmol/g或mmol/kg Fe²⁺当量，其中V单位为L，W单位为g或kg）
      • （可根据需要使用其他标准品，结果表示为相应标准品的当量浓度）
     

    计算公式示例（血清样品）：

    血清稀释倍数 (DF) = 5 (即1份血清+4份水)
    测得 A<sub>样品</sub> = 0.452
    标准曲线方程：Y = 0.950X + 0.005 (Y: 吸光度, X: Fe²⁺ mmol/L)
    代入：0.452 = 0.950 * X + 0.005
    解得：X = (0.452 - 0.005) / 0.950 ≈ 0.471 mmol/L Fe²⁺当量 (此浓度对应稀释后的样品浓度)
    血清实际FRAP值 = 0.471 mmol/L × 5 = 2.355 mmol/L Fe²⁺当量

 

五、 注意事项与应用范围

  • 反应时间： 4分钟是标准反应时间，必须严格控制以保证结果可比性。超过4分钟后反应可能未完全停止或背景变化增大。
  • 温度： 37°C是标准反应温度，温度波动影响反应速率。
  • 酸度： 醋酸盐缓冲液的pH值（3.6）非常关键，直接影响反应效率和特异性。
  • 干扰物质： 高浓度的蛋白质、脂类、胆红素、某些色素（尤其是样品本身颜色较深时）可能会干扰测定。需通过样品前处理（如离心、稀释、沉淀蛋白）尽量去除干扰。务必设置样品空白进行校正。
  • 样品稀释： 必须确保样品的吸光度值落在标准曲线的线性范围内。通常需要预实验确定最佳稀释倍数。
  • FRAP试剂的稳定性： 混合后的FRAP工作液在室温下相对稳定数小时（避光），但最好新鲜配制。TPTZ原液可在4°C避光保存较长时间。
  • 应用范围： FRAP法广泛应用于评估各类生物样品（血浆、血清、组织）、食品（水果、蔬菜、饮料、植物油）、植物提取物、药品等的总抗氧化能力（还原能力）。尤其对水溶性、脂溶性的酚类、黄酮类、抗坏血酸等具有良好响应。
  • 局限性： FRAP法主要检测具有还原能力的抗氧化剂（电子供体），对通过其他机制（如氢原子转移、淬灭单线态氧、螯合金属离子）发挥作用的抗氧化剂不敏感或响应弱（如蛋白质、谷胱甘肽、尿酸响应较好，而胡萝卜素、辅酶Q10响应弱）。不能反映硫醇类（-SH）抗氧化剂的全部能力。结果受所选标准品影响较大（常用Fe²⁺或抗坏血酸当量）。
 

六、 总结

FRAP法凭借其操作简便、耗时短、成本低、试剂稳定、重现性好等优点，成为评估样品总还原能力（即总抗氧化能力的一个重要方面）的常用方法。通过标准化的操作流程和严格的质量控制，可以获得可靠的结果，用于比较不同样品或同一样品在不同条件下的抗氧化能力差异。理解其原理、步骤和潜在的局限性对于结果的正确解读至关重要。

底部图片-PC版 底部图片-移动版