重组蛋白表达&纯化 - 中析研究所生物检测中心

重组蛋白，即利用基因工程技术，将外源基因导入宿主细胞，使其表达并产生目标蛋白质，已成为现代生命科学研究和生物医药产业的核心技术。其在抗体药物、疫苗开发、结构生物学、诊断试剂、酶工程等领域应用广泛。高效的重组蛋白表达与纯化工艺，是获取高活性、高纯度目标蛋白的关键环节。本文系统阐述从基因克隆到最终获得纯化蛋白的技术流程、策略与挑战。

第一部分：技术路线概览

重组蛋白生产遵循以下核心流程：

目标基因获取与优化
载体构建与克隆
宿主细胞选择与转化
表达培养与诱导
细胞收获与裂解
粗蛋白提取
蛋白纯化（多步层析）
浓缩、缓冲液置换与精制
质量检测与分析
保存

第二部分：基因克隆与载体构建

1. 目标基因来源

cDNA文库
PCR扩增（基因组DNA或cDNA模板）
化学合成基因（最优选择：密码子优化，特别是对于稀有密码子；去除隐秘剪接位点、不稳定序列）

2. 表达载体关键元件

启动子(Promoter) ：控制转录起始（T7/lac, T5/lac, AraBAD, AOX1, CMV等）
核糖体结合位点(RBS) ：（原核）决定翻译效率
多克隆位点(MCS) ：外源基因插入位点
融合标签(Expression Tag) ：常附加在基因N/C端以促进可溶性表达、简化纯化、提高产量：
- 纯化标签： His-tag (6xHis, 镍柱IMAC), GST (谷胱甘肽亲和层析), MBP (麦芽糖亲和层析), Flag, Strep-tag II
- 可溶性标签： MBP, GST, Trx, SUMO, NusA (特别适用于难溶蛋白)
筛选标记(Selection Marker) ：抗性基因（氨苄Amp, 卡那Kan, 博来霉素Ble, 潮霉素Hygro等）
起点(Origin of Replication, ori) ：决定拷贝数
(真核) 信号肽(Secretory Signal Sequence) ：引导分泌表达
(真核) 多聚腺苷酸化信号(PolyA) ：保证mRNA稳定性

3. 克隆策略

限制性内切酶 & DNA连接酶
无缝克隆/同源重组 (Gibson Assembly, In-Fusion, SLIC)：效率高、无序列限制
TA/TOPO克隆：简便快捷
Gateway克隆：适用于高通量
验证: 酶切鉴定、测序确认

第三部分：宿主表达系统选择（核心决策点）

宿主系统	代表宿主	优势	局限性
原核系统		成本低、操作简单、生长快、产量高	缺乏翻译后修饰（PTM）、易形成包涵体（不溶性聚集）、复杂蛋白难表达、毒素影响
大肠杆菌(E. coli)	BL21(DE3), Origami, Shuffle, Rosetta	最常用系统；Rosetta提供稀有tRNA；Shuffle促进二硫键形成；多种商业化载体与菌株	难以表达含二硫键多的真核蛋白或大于~80kDa的蛋白；无糖基化（无法用于生产治疗性抗体等需要修饰的蛋白）
真核系统		可进行复杂PTM（糖基化、磷酸化等）、可分泌表达、适于大分子量或复杂多聚体蛋白表达	成本高、操作复杂、周期长、产量可能较低
酵母
- 酿酒酵母(S. cerevisiae)	INVSc1, BY4741	遗传背景清晰、操作类似细菌、可糖基化	糖基化类型为高甘露糖型（与人不同、免疫原性问题）、分泌效率可能有限
- 毕赤酵母(Pichia pastoris)	X33, GS115, KM71H	高密度发酵、高产量、强诱导型启动子(AOX1)、可实现适度糖基化（需工程改造菌株）、高效分泌表达	糖基化仍需进一步人源化（常用菌株GlycoSwitch）、部分蛋白可能被酵母蛋白酶降解（需蛋白酶缺陷型菌株）
昆虫细胞
- 杆状病毒表达系统(BEVS)	Sf9, Sf21, High Five (BTI-TN-5B1-4)	适于大分子量蛋白、多亚基复合物；可进行复杂PTM（较酵母更接近哺乳动物）	需构建重组病毒、流程较长（~4-6周）、杆状病毒糖基化仍非完全人源化、存活力随感染时间下降
哺乳动物细胞
- 瞬时表达	HEK293, CHO, COS-7	可进行高度复杂且接近天然的人源PTM（糖基化模式最优）、表达复杂蛋白（如全长膜蛋白、复杂抗体）成功率高	瞬时转染成本极高、产量相对低（但近年提升显著）、培养条件要求高、批间差异可能稍大
- 稳定细胞系	CHO(最常用), NS0, SP2/0, HEK293	一旦建立，可大规模、稳定、持续生产高修饰蛋白（治疗性蛋白首选平台）	构建稳定细胞系周期长（3-6个月甚至更长）、成本高昂、需筛选高表达克隆

选择依据

蛋白性质：大小、结构复杂性（多聚体、结构域）、所需PTM（特别是糖基化对功能/治疗性的重要性）、二硫键数目与位置。
目标用途：研究用少量蛋白（原核/瞬时转染）vs. 结构解析（高纯度、可溶）vs. 治疗性生产（高PTM准确性、高稳定性、CHO为主）。
成本与时间要求。
表达形式：可溶？包涵体？分泌？

第四部分：蛋白表达优化（解决瓶颈）

通用策略

温度优化：降低温度（常降至16-25°C）促进可溶表达，尤其对于易聚集的蛋白。
诱导条件优化：
- 诱导时机（细胞生长阶段OD600）
- 诱导剂浓度（IPTG, 甲醇, 四环素等）
- 诱导时间（随宿主和目标蛋白变化）
培养基与培养条件：丰富培养基 vs. 确定成分培养基；溶解氧控制（尤其高密度发酵）。
融合标签策略（见前述） 。
分子伴侣/折叠酶共表达： (如E. coli中DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES系统；或表达PDI处理二硫键)。
启动子选择：强弱可控（如T7强，trc适中）。
密码子优化：使用宿主偏好的密码子，解决稀有密码子导致的翻译暂停和错误折叠。
信号肽筛选：对于分泌表达，选择高效信号肽（如PelB, OmpA, α-factor, HSA）。

应对包涵体表达

包涵体变复性策略：
- 收获细胞，裂解，离心收集包涵体。
- 用强变性剂（如6-8M尿素或4-6M盐酸胍）和还原剂（如10-100mM DTT或50mM β-巯基乙醇）溶解。
- 复性(Refolding) ：去除变性剂/还原剂，使蛋白重折叠。常用方法：
  - 稀释复性：直接稀释到复性缓冲液中（含氧化还原对、分子伴侣、精氨酸、低pH值等助溶剂）。
  - 透析复性：透析逐步降低变性剂浓度。
  - 柱上复性：蛋白结合在层析柱上（如IMAC）进行复性清洗。
- 复性成功率差异大、优化困难，是工艺瓶颈。
尝试其他宿主/标签/条件：优选实现可溶表达。哺乳动物/昆虫系统形成包涵体较少。

第五部分：细胞裂解与粗提物制备

收获细胞：离心或过滤。
裂解方法：
- 原核细胞/酵母：
  - 物理法： 高压均质 (最常用高效)、超声破碎 (小规模)、冻融研磨、珠磨。
  - 化学/酶法：溶菌酶处理（E. coli）、渗透压冲击、去垢剂（用于膜蛋白）。
- 昆虫/哺乳细胞：相对脆弱，常使用温和去垢剂裂解或反复冻融。大规模常用低压均质。
澄清(Centrifugation/Filtration) ：高速离心或深层过滤去除细胞碎片和大颗粒物，获得澄清的粗提物（裂解上清液） 。对于分泌表达蛋白，细胞上清即为粗提取物。关键步骤直接影响后续层析效果。

第六部分：蛋白纯化技术（层析法为核心）

纯化过程通常包含2-4步不同原理的层析步骤（Capture → Intermediate Purification → Polishing），以达到所需高纯度（常＞95%，治疗用要求更高）。

核心层析技术

类型	分离原理	特点/应用	关键点/缓冲液
亲和层析(Affinity Chromatography, AC)	生物特异性或强亲和力（标签-配基；抗原-抗体；酶-底物）	捕获步骤首选！特异性高、一步高纯度（80-95%）、载量高、纯化速度快。His-tag蛋白纯化的绝对主力 (His标签与固定化Ni²⁺/Co²⁺结合)。	结合：含适量咪唑(10-50mM)的缓冲液(pH~7-8)。洗脱：高浓度咪唑(150-500mM)竞争洗脱或低pH。防止金属离子脱落
离子交换层析(Ion Exchange Chromatography, IEX)	蛋白表面电荷与固定相带相反电荷离子基团静电作用	高分辨率、高载量、常用。阴离子交换层析(AEX): pH>pI时蛋白带负电荷(结合Q基团)。阳离子交换层析(CEX): pH<pI时带正电荷(结合S/SP基团)	通过改变缓冲液离子强度(盐浓度梯度)或pH梯度洗脱。起始低盐上样结合，提高盐浓度洗脱 (NaCl梯度)。缓冲液保持离子强度稳定
疏水作用层析(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)	蛋白疏水区与固定相疏水配基在高盐环境中作用力	基于表面疏水性分离，适于分离疏水性相近的杂质或去除聚集体。常作为中间纯化步骤	结合：高盐浓度 (1-2M (NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄)。洗脱：降低盐浓度（疏水作用减弱）。避免过高盐长时间作用致蛋白沉淀
尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography, SEC)/凝胶过滤(Gel Filtration, GF)	分子大小和形状（按水力学体积不同进入/排阻于凝胶孔）	精纯步骤核心！更换缓冲液（脱盐）、去除聚集体（多聚体/降解片段）、分离大小相近杂质效果佳。不依赖结合。	保持低流速，精确控制样品体积（＜柱体积2-5%）。常用缓冲液不含盐或含少量盐。分辨率高但载量低
混合模式层析(Multimodal/ Mixed Mode Chromatography, MMC)	同时包含多种作用力（如IEX+HIC/AC）	可能提供独特选择性，有效去除特定杂质，减少纯化步骤	结合/洗脱条件需优化（盐/离子强度/溶剂/配基浓度/pH）
(备选) 疏水电荷诱导层析(HCIC)	低盐下依赖电荷和疏水性的复杂相互作用	部分情况下可替代HIC，可在低盐下操作	优化条件与目标蛋白特性强相关

纯化策略组合示例

(His-Tag蛋白) : IMAC (Capture + 快速纯化) → IEX或HIC (Intermediate Purification) → SEC (Polishing, 脱盐/去聚集体) = >95%纯度标准流程。
(分泌型抗体-Fc融合蛋白) : Protein A/A/G/L亲和层析 (Capture, 特异结合Fc) → 低pH灭活病毒 (常用工艺) → CEX (流穿模式去除杂质如HCP/DNA/Protein A脱落或聚合物) → AEX (流穿模式进一步精纯) → (可选的) SEC/VF (精纯/浓缩) 。治疗性抗体核心流程。
(无标签可溶蛋白) : 粗提物适当前处理 (盐溶/盐析、超滤) → IEX (主要Capture/Intermediate) → HIC或MMC (Intermediate) → SEC (Polishing) 。

辅助技术

沉淀法：
- 硫酸铵沉淀：部分纯化与浓缩，去除部分杂质。
- 有机溶剂/聚合物沉淀：特定蛋白适用。
超滤/渗滤(Ultrafiltration/Diafiltration, UF/DF) ： 关键步骤! 用于浓缩样品、更换缓冲液（如纯化后将蛋白置换到储存缓冲液）、去除小分子杂质。根据目标蛋白分子量选择合适截留分子量(MWCO)的超滤膜。易造成膜吸附损失和剪切力（尤其在浓缩高浓度蛋白时需注意）。
病毒清除/灭活(治疗用) ：对生产过程中可能存在的病毒污染进行控制（如低pH孵育、S/D处理、纳米过滤、特殊层析）。
无菌过滤：最终制剂的分装前处理。

第七部分：质量检测与分析（确认纯度和特性）

纯度检测：
- SDS-PAGE (还原/非还原) ：最基础手段，直观观察主带大小和杂质带，分析纯度(Scan软件估测)。
- 高效液相色谱(HPLC) ：
  - SEC-HPLC：检测单体含量和聚合体/降解片段。
  - RP-HPLC (反相色谱)：高分辨率分离，检测微小杂质和疏水变异体。
  - IEX-HPLC：检测电荷异质性（如糖基化差异、脱酰胺化、氧化）。
浓度测定：
- UV280吸光度： (A_{280} = \frac{Absorbance}{extinction\ coefficient\ \times\ pathlength}) 快速简便。
- BCA/Bradford法：比色法，对抗干扰能力稍强。
分子量确认：
- SDS-PAGE：表观分子量。
- 质谱(Mass Spectrometry, MS)： 最准确分子量（尤其是MALDI-TOF或ESI），可检测PTM（如糖基化修饰、磷酸化、特定突变）。
结构表征：
- 圆二色谱(Circular Dichroism, CD)：评估二级结构（α-螺旋、β-折叠含量）。
- 动态光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)：评估溶液中蛋白大小分布和聚集体。
- (高阶) X射线晶体学/Cryo-EM/NMR：高级结构解析（科研常用）。
功能活性检测(Functional Assay) ： 核心！确保蛋白具有预期生物活性。根据蛋白性质选择特定方法（如酶促动力学、细胞活性检测、结合ELISA/SPR/BLI分析亲和力）。
其他：内毒素检测（LAL法，治疗用关键）、宿主细胞蛋白残留（HCP ELISA）、宿主DNA残留（qPCR）、Protein A残留（治疗性抗体）。

第八部分：工艺挑战与未来趋势

持续挑战

可溶性与折叠：难溶蛋白表达/复性仍是难点（占目标基因的30-50%）。
翻译后修饰(PTM)准确性：非哺乳动物系统（E. coli/酵母/昆虫）的糖基化等修饰与人体差异显著，限制了其应用（需工程改造宿主或选用哺乳动物）。
宿主相关杂质清除：高效去除HCPs/HCDNA（残留是关键质量属性CQA）。
聚体控制：防止加工/储存中聚集体形成（SEC虽有效但其载量和通量低）。
成本与效率：哺乳动物细胞培养与纯化过程成本高昂（治疗性蛋白瓶颈）。
工艺放大(Scale-Up) ：从实验室规模放大到生产规模保持产品质量一致性的复杂性（流体特性、层析柱均一性等）。
生物安全风险(病毒/朊病毒) ：特别是人/动物源性原材料的使用。

创新趋势

人工智能与机器学习(AI/ML) ：
- 预测蛋白溶解性/表达水平/PTM位点/聚集倾向，指导基因和宿主优化。
- 预测层析图谱优化分离条件。
- 辅助细胞培养过程控制。
细胞培养技术创新：
- 持续流培养（Perfusion）提高细胞密度和产量。
- 细胞株工程改造优化生长、代谢、蛋白质量。
- 无血清/化学成分确定培养基开发提高安全性和一致性。
新型表达系统：
- 体外无细胞表达系统(Cell-Free Protein Synthesis, CFPS) ：灵活快速小规模表达，可引入非天然氨基酸，无细胞限制。成本是限制因素。
- 工程化藻类、植物细胞系（生物安全性好，成本潜力）。
先进纯化技术：
- 连续流层析(Continuous Chromatography) ：提高层析柱利用率和生产效率，减少缓冲液消耗（如模拟移动床SMB技术）。
- 高容量/高选择性层析介质：改进配基设计（如高载量Protein A填料、新型多肽配基）。
- 膜层析(Membrane Chromatography) ：利用膜对流特性加快流速，适合早期Captuer和大体积样品处理，逐步用于最后精纯。
- 多维度/集成纯化工艺平台：减少步骤提高效率。
高度自动化与微型化：高通量筛选表达克隆与纯化条件（配合96/384孔板、机械臂）。
精准糖工程与修饰控制：在CHO等宿主中精确调控糖链结构（如开发均一的Fc-岩藻糖敲除抗体提高ADCC效应）。

结论

重组蛋白表达与纯化是一个高度技术性和策略性的过程。从最初的基因设计优化、到宿主表达系统的精确选择、再到裂解和高效多步层析纯化策略的制定，每个环节都深刻影响最终产物的产量、纯度、活性和稳定性。尽管面临诸多技术挑战（如蛋白折叠、PTM调控、杂质清除、成本控制），但不断涌现的新技术和智能化方法（AI、连续生产、新型表达平台）正持续提升工艺效率和产品质量。对基本原理的透彻理解、对细节的精准把控以及对新技术的敏锐洞察与应用，是成功获取功能活性重组蛋白的基石。随着生物药市场的持续增长和精准生物医学的深化，重组蛋白表达纯化技术将继续向着更高效率、更高可靠性、更低成本、更智能化的方向演进。