闭合型急性脊髓损伤模型(大/小鼠)

闭合型急性脊髓损伤模型(大/小鼠)检测项目详解

一、模型简介

闭合型急性脊髓损伤(SCI)模型旨在模拟临床最常见的创伤性脊髓损伤(如车祸、坠落)，特点是硬脊膜完整，但脊髓组织内部发生挫伤、出血、水肿、坏死等一系列病理生理变化。核心目标是评估损伤严重程度、病理进程及潜在治疗干预的效果。

二、常用建模方法

1. 重物坠落法(Weight Drop, WD)：
   • 原理： 将动物固定于立体定位仪，暴露目标椎板(T8-T10最常见)，用特定重物从设定高度垂直坠落撞击暴露的硬脊膜/脊髓。
   • 特点： 操作相对简单，可较好控制撞击力(通过重物质量和高度调节)，但撞击点定位、力传导一致性是挑战。是应用最广泛的模型之一。
2. 动脉瘤夹钳夹法(Aneurysm Clip Compression)：
   • 原理： 椎板切除暴露目标节段脊髓，使用标准化动脉瘤夹(设定闭合力矩)夹持脊髓一定时间(如1分钟)。
   • 特点： 损伤程度(由闭合力矩和夹持时间决定)高度可控且可重复性好，能模拟持续压迫损伤(如骨折碎片压迫)。手术要求较高。
3. 无限撞击器法(Infinite Horizon Impactor, IH)：
   • 原理： 计算机控制的精密撞击装置，可精确设定撞击力(毫牛级)或位移深度，撞击脊髓。
   • 特点： 损伤参数(力、位移)高度精确可控，重复性最佳，但设备昂贵。
4. 球囊压迫法(Balloon Compression)：
   • 原理： 通过椎间孔或椎板间隙将微小球囊导管插入椎管硬膜外腔，充气膨胀压迫脊髓一定时间。
   • 特点： 非开放性操作(可经皮)，模拟硬膜外血肿或肿瘤压迫，损伤程度由球囊直径、充气压力和时间控制。

三、核心检测项目 (重点详解)

评估需多维度、多时间点进行，贯穿急性期、亚急性期至慢性期。

• 1. 行为学评估 (重中之重 - 功能恢复的金标准)
  • 运动功能：
    • BBB评分(Basso, Beattie, Bresnahan Scale)： 大鼠最经典、最常用的开放性运动功能评分系统(0-21分)，评估后肢关节活动、协调性、躯干稳定性、步态等。需双盲评分。
    • BMS评分(Basso Mouse Scale)： 小鼠专用运动功能评分系统(0-9分)，原理类似BBB但针对小鼠特点优化。
    • 斜板试验(Inclined Plane Test)： 评估动物在逐渐增大的倾斜角度上维持姿势的能力，反映肢体力量和躯干控制。
    • 足迹分析(Footprint Analysis)： 动物足底涂色行走于白纸，测量步长、步宽、旋转角度等参数，量化步态异常和协调性。
    • 网格行走/水平梯测试(Grid Walk/Horizontal Ladder Test)： 动物在网格或横杆上行走，记录足部滑落或踩空次数，评估精细运动协调和本体感觉。
    • 自发活动监测(Open Field Test)： 记录动物在空旷场地的总移动距离、速度、中央区探索时间等，评估整体活动能力和焦虑状态(常作为辅助)。
  • 感觉功能 (常被忽视但重要)：
    • 机械痛觉过敏(Von Frey Filaments)： 用不同硬度细丝刺激足底/后肢，记录缩足阈值，评估异常性疼痛(触诱发痛)。
    • 热痛觉过敏(Hargreaves Test)： 聚焦热光源照射足底，记录缩足潜伏期，评估热痛觉过敏。
    • 冷刺激试验(Cold Allodynia)： 将丙酮或冷金属棒轻触皮肤，观察异常反应(如过度舔舐、甩腿)。
• 2. 组织病理学评估 (揭示损伤与修复的微观基础)
  • 取材与固定： 麻醉后经心灌注(先生理盐水，后4%多聚甲醛)。完整取出包含损伤中心及上下至少1-2cm的脊髓段。后固定，脱水，石蜡或最佳是OCT包埋冰冻切片。
  • 染色与观察：
    • 苏木精-伊红染色(HE)： 基础评估：观察组织整体结构、坏死空洞大小、出血、炎症细胞浸润、神经元形态(尼氏体消失、核固缩)。
    • Luxol Fast Blue (LFB) / 固蓝染色： 特异性染色髓鞘，直观显示脱髓鞘区域(损伤中心及远端的白质束)。
    • 尼氏染色(Nissl Staining, e.g., Cresyl Violet)： 特异性染色神经元胞体，清晰显示存活神经元数量(主要在灰质前角)及其形态(尼氏体分布)。
    • 免疫组织化学/免疫荧光(IHC/IF)：
      • 神经元标记： NeuN (成熟神经元), β-III Tubulin (神经元轴突/胞体), ChAT (运动神经元)。
      • 星形胶质细胞/胶质瘢痕： GFAP (上调表示反应性星形胶质细胞增生)。
      • 小胶质细胞/巨噬细胞/炎症： Iba-1 (所有髓系细胞), CD68 (M1型促炎巨噬/小胶), CD206 (M2型抗炎修复巨噬/小胶), CD11b, TNF-α, IL-1β等。
      • 少突胶质细胞/髓鞘再生： Olig2 (少突前体细胞), APC/CC1 (成熟少突胶质细胞), MBP (髓鞘碱性蛋白)。
      • 轴突再生/生长锥： GAP-43, NF200 (神经丝蛋白)。
      • 凋亡： Cleaved Caspase-3, TUNEL (标记凋亡细胞)。
      • 血管： RECA-1 (内皮细胞), Laminin (基底膜)。
    • 定量分析： 使用图像分析软件(如ImageJ, Imaris)对特定区域(如损伤中心、头尾端特定距离)的阳性染色面积、细胞数量、荧光强度等进行标准化定量。计算空洞面积/体积、神经元存活率、胶质瘢痕厚度、炎症细胞密度等。
  • 电子显微镜(EM)： (高分辨率，揭示超微结构变化) 观察轴突完整性(断裂、肿胀)、髓鞘状态(脱失、薄髓鞘)、突触结构、胶质细胞形态、血管内皮连接等。技术复杂，样本量通常较小。
• 3. 分子生物学检测 (探索机制)
  • 取材： 快速取出目标脊髓节段(通常损伤中心及邻近组织)，液氮速冻或放入RNA later，-80°C保存。
  • 基因表达：
    • 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)： 检测特定mRNA表达水平(炎症因子TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10；凋亡相关Bax, Bcl-2, Caspases；神经营养因子BDNF, NGF, NT-3；胶质细胞标记物GFAP, Iba-1, CD68等)。需内参基因(GAPDH, β-actin)。
    • RNA测序(RNA-Seq)： 无偏倚地检测全转录组变化，发现新的靶点或通路。
  • 蛋白表达与修饰：
    • Western Blot(WB)： 检测特定蛋白的表达量及活化状态(如磷酸化水平)，如炎症因子、凋亡蛋白、神经营养因子受体、信号通路蛋白(Akt, ERK, STAT3等)、胶质细胞标志物。需内参蛋白(β-actin, GAPDH)。
    • 酶联免疫吸附试验(ELISA)： 定量检测组织匀浆或血清/脑脊液中特定蛋白(如炎症因子、GFAP, NSE等生物标志物)的浓度。灵敏度高。
• 4. 电生理学评估 (评估神经传导通路功能)
  • 运动诱发电位(Motor Evoked Potentials, MEPs)： 在大脑运动皮层施加电或磁刺激，在目标肌肉(如胫前肌)或坐骨神经记录复合肌肉动作电位(CMAP)。评估下行运动传导通路的完整性。潜伏期延长、波幅降低提示传导障碍。
  • 体感诱发电位(Somatosensory Evoked Potentials, SSEPs)： 刺激后肢感觉神经(如胫神经)，在大脑皮层体感区记录电位。评估上行感觉传导通路的完整性。潜伏期延长、波幅降低提示传导障碍。
  • 肌电图(EMG)： 记录肌肉在静息和收缩时的电活动，评估神经肌肉接头功能及是否存在异常自发电位(如纤颤电位提示失神经支配)。
  • 磁刺激/经颅磁刺激(TMS)： (更适合慢性期或清醒动物) 非侵入性评估皮质脊髓束功能。
• 5. 影像学评估 (活体、动态监测)
  • 磁共振成像(MRI)：
    • T2加权像： 清晰显示损伤区域水肿、出血(急性期高信号)、空洞形成(慢性期低信号囊腔)。
    • 弥散张量成像(DTI)： 量化评估白质纤维束的完整性和方向性(FA值降低提示轴索损伤/脱髓鞘)。
    • 磁共振波谱(MRS)： 检测损伤区域代谢物变化(如NAA降低提示神经元损伤/丢失，Cho升高提示细胞膜代谢活跃/炎症，Lac升高提示缺血/糖酵解)。
  • 微型计算机断层扫描(Micro-CT)： 高分辨率评估脊柱骨性结构损伤(如骨折、脱位)，对建模操作有反馈价值。

四、关键实验设计与分析要点

1. 严谨分组： 假手术组(仅打开椎板，不损伤脊髓)、损伤对照组(SCI模型)、治疗组。随机分组。
2. 双盲评估： 行为学评分、组织学分析等应由不知晓分组情况的研究者进行。
3. 时间点选择：
   • 急性期(0-3天)： 行为学(早期BBB/BMS下降)、组织学(出血、水肿、坏死、炎症爆发)、分子检测(炎症因子高峰)、MRI(水肿)。
   • 亚急性期(3-14天)： 行为学(开始平台或缓慢恢复)、组织学(空洞形成、胶质瘢痕启动、轴突退变/脱髓鞘)、分子检测(持续炎症、凋亡、胶质反应)。
   • 慢性期(>14天 - 数周/月)： 行为学(功能恢复平台期或缓慢改善)、组织学(稳定空洞、成熟胶质瘢痕、髓鞘再生/轴突萌芽尝试)、电生理、长期MRI。
4. 统计分析： 根据数据类型选择合适的检验方法(t检验、ANOVA、重复测量ANOVA、非参数检验等)。报告效应量和置信区间。避免仅依赖p值。

五、模型成功与影响因素

• 成功标志： 建模后动物出现预期的、显著且持续的后肢运动功能障碍(BBB/BMS显著下降)，组织学证实明确的脊髓损伤病灶。
• 关键影响因素：
  • 动物品系、年龄、性别、体重： 标准化。
  • 麻醉深度与维持： 确保动物无痛且生理稳定。
  • 手术操作熟练度与无菌： 减少手术本身创伤和感染。
  • 损伤参数精确控制： (力度、位移、压迫时间)。
  • 术后护理： 保暖、补液、人工排尿(至关重要！防止膀胱破裂/感染)、预防褥疮、必要时补充营养。术后护理是影响动物存活率和模型稳定性的关键因素。
  • 并发症管理： 尿路感染、褥疮、自残(少见)。

六、总结

闭合型急性SCI模型是研究脊髓损伤病理机制和治疗策略的基石。其检测项目需覆盖功能(行为学、电生理)、结构(组织学、影像学)、分子机制多个层面，并在合理的时间点进行。严谨的实验设计、标准化的操作流程、精细的术后护理以及客观的双盲评估是获得可靠、可重复结果的关键。选择哪些检测项目应根据具体研究目的和科学问题来决定。

重要参考文献与资源：

• Basso DM, et al. (1995) Basso, Beattie, Bresnahan Locomotor Rating: Reliable and Valid. Exp Neurol.
• Basso DM, et al. (2006) Basso Mouse Scale for Locomotion. J Neurotrauma.
• Young W. (2002) Spinal Cord Contusion Models. In: Animal Models of Acute Neurological Injuries.
• Kwon BK, et al. (2010) Translational Research in Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. (讨论模型与临床的转化)
• Frontiers in Neurology / Journal of Neurotrauma / Experimental Neurology 等期刊相关专题。
• NIH/NINDS Common Data Elements for SCI: 提供标准化的评估建议。

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