ABPP 基于活性的蛋白质组学分析

发布时间：2025-06-13 18:37:22 阅读量：6 作者：生物检测中心

ABPP：基于活性的蛋白质组学分析——照亮蛋白质功能的“活性世界”

引言：超越丰度的认知

蛋白质是生命活动的核心执行者。传统蛋白质组学研究（如质谱分析）主要关注蛋白质在细胞或组织中的整体表达水平（丰度）。然而，蛋白质的丰度与其实际的功能活性状态（例如酶的催化活性、受体的配体结合能力）往往并不直接等同。翻译后修饰、亚细胞定位、蛋白相互作用以及小分子抑制剂/激活剂的存在等因素，都可能在不显著改变蛋白质总量的情况下，动态地调节其功能活性。基于活性的蛋白质组学分析（Activity-Based Protein Profiling， ABPP）应运而生，它提供了一种强大的化学蛋白质组学策略，专门用于在复杂的蛋白质组中直接探测和识别处于特定功能活性状态的蛋白质，特别是酶类。

ABPP的核心原理：化学探针的精准标记

ABPP技术的核心在于设计和使用一类被称为“活性导向探针”（Activity-Based Probes， ABPs）或简称“活性探针”的特殊化学分子。这些探针的设计具有高度策略性，通常包含三个关键功能模块：

  1. 化学反应基团（弹头，Warhead）：

    • 这是探针发挥“活性导向”功能的核心部分。
    • 它能够选择性、共价地与目标蛋白质（主要是酶）活性位点中的特定亲核性氨基酸残基（如丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸的侧链）发生化学反应。
    • 这种结合通常是基于酶催化机制本身的特性，意味着探针只有在目标酶处于其活性构象、且活性位点可接近时才能有效结合并形成稳定的共价复合物。
    • 例如，针对丝氨酸水解酶（如蛋白酶、酯酶、脂肪酶）的探针常使用膦酸酯、氟膦酸酯或β-内酯等作为弹头，模拟其天然底物反应过渡态。

  2. 连接臂（Linker）：

    • 这是一个连接弹头和报告基团的化学间隔区。
    • 它的作用是提供必要的空间位阻或灵活性，以确保弹头能顺利进入目标酶的活性口袋进行反应，同时报告基团在标记后也不会过度干扰后续的富集或检测步骤。
    • 连接臂的长度和化学性质可以根据目标蛋白质的结构特点进行优化。

  3. 报告基团（Reporter Tag）：

    • 这个模块赋予探针可检测性或亲和性。
    • 经典ABPP： 通常使用生物素（Biotin） 或荧光基团（如荧光素、罗丹明）。生物素用于后续基于链霉亲和素珠的高效亲和富集标记的蛋白质或多肽。荧光基团则允许直接在凝胶电泳（如SDS-PAGE）后通过荧光扫描仪进行可视化，比较不同样品间活性蛋白质谱的差异（差异ABPP）。
    • 基于点击化学的ABPP（CuAAC或SPAAC）： 使用小型的生物正交基团，如叠氮化物（Azide）或环辛炔（Cyclooctyne），作为报告基团。标记反应完成后，通过高效的点击化学反应（如铜催化的叠氮-炔环加成反应CuAAC或无铜的应变促进的叠氮-炔环加成反应SPAAC），将与带有互补基团（如炔烃或叠氮化物）的生物素或荧光报告分子连接起来。这种方法提高了探针在活细胞/活体中的兼容性（避免大基团干扰），并简化了探针设计。

ABPP的工作流程：捕获、富集、鉴定、分析

一个典型的ABPP实验包含以下关键步骤：

  1. 探针孵育： 将设计好的活性导向探针加入到目标生物样本（如细胞裂解物、完整活细胞、组织匀浆液、甚至活体动物模型）中。
  2. 活性依赖标记： 探针中的化学反应基团（弹头）选择性地、共价地结合到处于活性状态的目标酶（如丝氨酸水解酶、半胱氨酸蛋白酶、激酶、去泛素化酶等）的活性位点上。非活性状态的酶通常无法有效结合探针。
  3. 样品处理：
    • 直接检测（荧光ABPP）： 如果探针带有荧光基团，样品经SDS-PAGE分离后，直接用荧光扫描仪成像，观察不同样品间活性酶条带的差异。
    • 富集与鉴定（质谱ABPP）：
      • 若探针带有生物素，则用链霉亲和素包裹的磁珠/琼脂糖珠富集标记的蛋白质。
      • 若使用基于点击化学的探针，则先进行点击化学反应引入生物素或荧光标签，再进行富集（或直接进行荧光凝胶分析）。
      • 富集到的蛋白质复合物在珠上或洗脱后进行胰蛋白酶酶解。
  4. 质谱分析（LC-MS/MS）： 酶解后的多肽混合物进行液相色谱-串联质谱分析，鉴定被探针标记的蛋白质（通过识别含有探针修饰特征的多肽）。
  5. 数据分析： 利用生物信息学工具处理质谱数据，鉴定标记的蛋白质，量化标记程度（通常通过谱图计数或同位素标记定量技术如SILAC、TMT、LFQ等），并进行后续的功能注释和通路分析。差异ABPP则需要比较不同处理组（如疾病vs对照、药物处理vs未处理）活性蛋白质谱的变化。

ABPP的强大应用：从基础研究到药物发现

ABPP因其直接探测蛋白质功能活性的独特能力，在多个领域展现出强大的应用价值：

  1. 酶功能注释与发现：

    • 大规模鉴定具有特定催化活性（如丝氨酸水解酶活性、半胱氨酸蛋白酶活性）的蛋白质成员，即使这些蛋白尚未被充分研究或功能未知。
    • 揭示特定酶家族成员在特定生理或病理条件下的活性变化。
    • 发现具有新功能或活性的酶。

  2. 疾病生物标志物发现：

    • 通过比较健康与疾病组织（如癌症、炎症性疾病、神经退行性疾病）的活性蛋白质谱，识别在疾病状态下特异性激活或失活的酶，这些酶可能作为诊断、预后或疗效监测的潜在生物标志物。活性标志物往往比丰度标志物更能反映病理状态。

  3. 药物靶点发现与验证：

    • 靶点识别： 利用竞争性ABPP（见下文），直接从复杂蛋白质组中识别能与特定小分子抑制剂/药物候选物结合的活性靶点蛋白。
    • 靶点选择性评估： 评估药物分子在生理条件下对其预期靶点的选择性，以及潜在的脱靶效应，这对于药物的安全性和有效性至关重要。ABPP能在全蛋白质组水平提供高可信度的选择性数据。
    • 药物作用机制研究： 阐明药物如何调节其靶点的活性状态（激活或抑制）。

  4. 抑制剂筛选与优化：

    • 利用竞争性ABPP策略高通量筛选针对特定酶家族或特定酶的抑制剂。
    • 定量评估抑制剂对不同靶点的抑制效力（IC50值）和选择性谱。ABPP提供的是细胞/组织内真实环境下的靶点占有率数据。

  5. 代谢酶活性谱分析：

    • 研究代谢通路中关键酶（如细胞色素P450、酯酶、酰胺酶）的活性调控及其在药物代谢、毒理学中的作用。

  6. 宿主-病原体相互作用：

    • 研究病原体（如病毒、细菌、寄生虫）在感染过程中利用或调控宿主酶活性的机制，以及病原体自身关键酶活性在宿主环境中的状态。

ABPP的变体与进化：竞争性ABPP（竞争性实验）

竞争性ABPP是ABPP技术体系中一个极其重要的应用模式：

  • 原理： 在加入活性导向探针之前，先用候选的小分子化合物（如抑制剂、激动剂或其他探针）预处理样品。如果该小分子化合物能结合并占据目标酶的活性位点，它就会阻止后续活性导向探针对该酶的结合和标记。
  • 检测：
    • 凝胶分析： 在荧光ABPP中，与未处理样品相比，若某个荧光条带强度减弱或消失，说明预处理的小分子与该条带对应的活性酶发生了相互作用。
    • 质谱分析： 通过定量比较加入抑制剂前后被探针标记的蛋白质（或多肽）的丰度变化（通常需要定量蛋白质组学方法），可以精确鉴定被小分子抑制的靶点及其抑制程度。
  • 应用： 这是发现药物靶点、评估抑制剂选择性、筛选化合物库的最常用策略之一。它能够在复杂的原生环境中直接揭示小分子与活性蛋白质靶点的相互作用。

ABPP的优势与挑战

  • 优势：

    • 活性导向： 直接检测蛋白质的功能活性状态，弥补了单纯丰度信息的不足。
    • 高选择性： 探针设计针对特定酶家族或活性位点化学机制，实现选择性标记。
    • 高灵敏度： 亲和富集步骤显著降低样品复杂度，提高低丰度活性蛋白的检出率。
    • 全局性： 提供全蛋白质组范围内特定活性酶谱的快照（“Activity Profile”）。
    • 细胞原生环境兼容性： 能在活细胞甚至活体动物中进行标记，更接近生理状态。
    • 强大的靶点发现与验证能力： 特别是结合竞争性实验策略。
    • 提供定量信息： 结合定量质谱方法，可以对活性变化进行精确定量。

  • 挑战与局限：

    • 探针开发的复杂性： 设计具有良好选择性、灵敏度、细胞渗透性和低背景结合的探针需要深入的化学和生物学知识，周期较长。现有探针主要集中在特定酶类（尤其是水解酶）。
    • 覆盖范围限制： 目前还不能覆盖所有类型的酶和所有蛋白质（尤其是非酶类蛋白）。不同酶类的活性探针开发难度差异很大。
    • 特异性控制： 探针仍可能与非特异性靶点结合，或对同一家族内高度同源的酶区分度不足，需要精心设计和严格的对照实验验证。
    • 活体应用的渗透性/药代动力学： 在复杂的活体系统中，探针的组织分布、代谢清除等问题需要考量。
    • 数据解析复杂性： 大规模的质谱数据需要专业的生物信息学分析流程和数据库支持。

前沿发展与未来方向

ABPP技术仍在不断发展和完善中：

  1. 新型探针开发： 拓展覆盖范围至更多酶家族（如激酶、磷酸酶、去泛素化酶、糖基转移酶等）以及非酶蛋白（如蛋白-蛋白相互作用研究）。
  2. 多功能探针： 整合成像、治疗（Theranostic Probes）或其他功能于一体。
  3. 超高分辨率/原位ABPP： 结合显微成像技术（如超分辨显微镜），在亚细胞水平可视化活性蛋白的分布。
  4. 活体/组织水平的ABPP成像： 开发适合活体成像的近红外荧光探针或生物发光探针。
  5. 光激活ABPP： 利用光来控制探针的活性，实现时空特异性的标记。
  6. 深度定量活性组学： 结合更先进的质谱定量技术（如DIA）和生物信息学算法，实现更深层次、更精准的活性蛋白质组定量分析。
  7. 结合其他组学技术： 整合转录组学、代谢组学等数据，构建更全面的生物学图景。

结论：照亮“活性组”的明灯

基于活性的蛋白质组学分析（ABPP）作为一种革命性的化学蛋白质组学技术，通过巧妙的活性导向探针设计，突破了传统蛋白质组学仅关注丰度的局限，为我们提供了在复杂的生物系统中直接探测、定量和鉴定处于功能活性状态的蛋白质（尤其是酶）的独特视角。它在酶功能发现、疾病机制研究、生物标志物发掘、药物靶点识别与验证、抑制剂筛选与优化等方面展现出无可比拟的优势。尽管在探针开发和覆盖范围等方面仍面临挑战，但随着化学工具、质谱技术和计算方法的不断进步，ABPP必将继续深化我们对蛋白质功能调控网络的动态理解，并在转化医学和药物研发中发挥越来越关键的作用，成为照亮生命活动背后“活性组”（Activity Proteome）世界的核心明灯。