好的，以下是根据中国国家标准 GB 5009.111-2015《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》 整理的完整检测方法说明，严格遵循要求，不包含任何企业名称。
GB 5009.111-2015 食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定
1 范围
本标准规定了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）及其乙酰化衍生物（3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇, 3-Ac-DON 和 15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇, 15-Ac-DON）的免疫亲和层析净化高效液相色谱测定方法。
本标准适用于谷物及其制品（如小麦、玉米、大麦、大米、面粉、麦片、面包等）中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定。
2 原理
试样用乙腈-水溶液（84+16, v/v）提取，提取液经稀释、过滤后，通过含有特异性抗体的免疫亲和柱进行净化和富集。目标毒素（DON, 3-Ac-DON, 15-Ac-DON）被特异性吸附在亲和柱上，用水淋洗去除杂质后，用甲醇将目标毒素洗脱。洗脱液经氮气吹干后用甲醇-水溶液定容，采用高效液相色谱仪进行分离，紫外检测器或二极管阵列检测器（DAD）检测，外标法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
- 3.1 乙腈 (CH₃CN)： 色谱纯。
- 3.2 甲醇 (CH₃OH)： 色谱纯。
- 3.3 氯化钠 (NaCl)。
- 3.4 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄)。
- 3.5 磷酸二氢钾 (KH₂PO₄)。
- 3.6 磷酸 (H₃PO₄)： 85%，优级纯。
- 3.7 提取液： 乙腈-水溶液（84+16, v/v）。量取840 mL乙腈（3.1）与160 mL水混合。
- 3.8 淋洗缓冲液： 称取25.0 g氯化钠（3.3）、5.0 g磷酸氢二钠（3.4）、0.5 g磷酸二氢钾（3.5）溶于约950 mL水中，用磷酸（3.6）调节pH至7.0，加水定容至1000 mL。临用前用水稀释10倍（如取10 mL加水90 mL）。
- 3.9 洗脱液： 甲醇（3.2）。
- 3.10 定容液： 甲醇-水溶液（20+80, v/v）。量取20 mL甲醇（3.2）与80 mL水混合。
- 3.11 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Ac-DON）、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-Ac-DON）标准品： 纯度≥98%。
- 3.12 标准储备溶液（约100 µg/mL）： 分别准确称取适量（精确至0.1 mg）DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON标准品（3.11），用甲醇（3.2）溶解并定容，配制成浓度约为100 µg/mL的标准储备液。-18℃以下避光保存，有效期3个月。
- 3.13 混合标准中间溶液（约10 µg/mL）： 分别准确吸取适量DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON标准储备溶液（3.12），用甲醇（3.2）稀释并定容，配制成每种目标物浓度约为10 µg/mL的混合标准中间溶液。-18℃以下避光保存，有效期1个月。
- 3.14 混合标准工作溶液： 临用前，根据需要，用定容液（3.10）将混合标准中间溶液（3.13）逐级稀释成一系列浓度（如：0.01 µg/mL, 0.05 µg/mL, 0.10 µg/mL, 0.20 µg/mL, 0.50 µg/mL, 1.00 µg/mL）的混合标准工作溶液。
- 3.15 免疫亲和柱： 柱容量≥1000 ng DON（经验证符合要求的商品化免疫亲和柱）。
- 3.16 玻璃纤维滤纸： 孔径约1.6 µm。
- 3.17 微孔滤膜： 有机系，孔径0.22 µm。
4 仪器和设备
- 4.1 高效液相色谱仪： 配紫外检测器或二极管阵列检测器（DAD）。
- 4.2 分析天平： 感量0.0001 g和0.01 g。
- 4.3 均质器： 转速≥15000 r/min。
- 4.4 振荡器： 往复式或旋转式。
- 4.5 离心机： 转速≥4000 r/min。
- 4.6 氮吹仪： 可控温。
- 4.7 涡旋混合器。
- 4.8 移液器： 量程10 µL ~ 1000 µL。
- 4.9 玻璃注射器： 10 mL。
- 4.10 容量瓶： 10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL。
- 4.11 具塞离心管： 50 mL。
- 4.12 玻璃试管： 10 mL, 具塞。
5 分析步骤
5.1 试样制备与保存
取有代表性样品至少500 g，用粉碎机粉碎并通过孔径≤1.0 mm的筛网。混合均匀，分成两份，装入洁净容器中，密封并标记。于-18℃以下避光保存。
5.2 提取
称取25.0 g（精确至0.1 g）试样（5.1）于50 mL具塞离心管（4.11）中。加入5.0 g氯化钠（3.3）和100.0 mL提取液（3.7）。以均质器（4.3）高速均质2 min（或于振荡器（4.4）上剧烈振荡30 min）。于4000 r/min离心5 min（或静置分层）。准确移取10.0 mL上清液于另一50 mL具塞离心管中，加入40.0 mL水稀释，混匀。用玻璃纤维滤纸（3.16）过滤，收集滤液备用。
5.3 净化
将免疫亲和柱（3.15）连接在玻璃注射器（4.9）下。准确移取10.0 mL滤液（5.2）以约1滴/秒的流速通过亲和柱（控制流速，避免过快）。用10 mL淋洗缓冲液（3.8）以约1滴/秒的流速淋洗亲和柱两次，弃去全部流出液。抽干亲和柱。用2.0 mL洗脱液（3.9）以约1滴/秒的流速洗脱目标毒素，收集洗脱液于10 mL玻璃试管（4.12）中。再用2.0 mL洗脱液（3.9）重复洗脱一次，合并洗脱液（共约4.0 mL）。
5.4 浓缩与定容
将洗脱液（5.3）置于50℃以下水浴中，用氮气（4.6）缓慢吹干。用定容液（3.10）溶解残渣并定容至1.0 mL，涡旋混匀（4.7）。溶液经0.22 µm微孔滤膜（3.17）过滤，收集滤液作为试样溶液，供高效液相色谱测定。
5.5 高效液相色谱参考条件
- 色谱柱： C18柱，柱长150 mm，内径4.6 mm，粒径5 µm（或等效柱）。
- 柱温： 35 ℃。
- 流动相： 甲醇（3.2）-水（20+80, v/v）。
- 流速： 0.8 mL/min。
- 检测波长： 紫外检测器：218 nm；DAD检测器：扫描范围200~300 nm，定量波长218 nm。
- 进样量： 20 µL ~ 100 µL（根据仪器灵敏度和目标物浓度确定）。
5.6 标准曲线的制作
将混合标准工作溶液（3.14）按浓度由低到高的顺序依次注入高效液相色谱仪（4.1），按照5.5的色谱条件进行测定。记录目标毒素（DON, 3-Ac-DON, 15-Ac-DON）的保留时间和峰面积（或峰高）。以目标毒素的浓度为横坐标，对应的峰面积（或峰高）为纵坐标，绘制标准曲线或计算线性回归方程。标准系列溶液应覆盖试样溶液中目标毒素的浓度范围。
5.7 试样测定
将试样溶液（5.4）注入高效液相色谱仪（4.1），按照5.5的色谱条件进行测定。记录目标毒素的保留时间和峰面积（或峰高）。根据目标毒素的保留时间定性，根据其峰面积（或峰高）和标准曲线（或线性回归方程）定量。试样溶液中目标毒素的响应值应在标准曲线的线性范围内，否则需稀释后重新进样测定。
6 分析结果的表述
6.1 计算
试样中目标毒素（DON, 3-Ac-DON, 15-Ac-DON）的含量按式（1）计算：
式中：
X— 试样中目标毒素的含量，单位为微克每千克（µg/kg）；c— 从标准曲线上查得的试样溶液中目标毒素的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；V— 试样溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）（本方法为1.0 mL）；f— 稀释倍数（若试样溶液在测定前经过稀释）；m— 最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克（g）。本方法中，m = 25.0 g × (10.0 mL / 100.0 mL) × (10.0 mL / 50.0 mL) = 0.5 g。1000— 单位换算系数（克到千克，微克每毫升到微克每千克）。
计算结果保留三位有效数字。
6.2 结果表示
当测定值小于10 µg/kg时，保留到小数点后一位；当测定值大于等于10 µg/kg时，保留三位有效数字。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
8 其他
本方法对谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的检出限（LOD）为5 µg/kg，定量限（LOQ）为15 µg/kg；对3-Ac-DON和15-Ac-DON的LOD为10 µg/kg，LOQ为30 µg/kg。（注：实际检出限和定量限可能因仪器和操作条件略有差异，实验室应进行验证）。
重要说明：
- 免疫亲和柱选择： 必须选择经过充分验证、符合标准要求（柱容量≥1000 ng DON）的商品化免疫亲和柱。不同供应商的柱子性能可能有差异，更换品牌时需重新验证方法性能。
- 流速控制： 在过柱和淋洗步骤中，严格控制流速（约1滴/秒）至关重要，过快会导致净化效果不佳或毒素损失。
- 氮吹温度： 浓缩洗脱液时，温度应低于50℃，避免目标毒素分解。
- 标准品与试剂： 使用高纯度标准品和色谱纯试剂，确保检测准确性。
- 方法验证： 实验室在初次使用该方法或更换关键试剂/耗材（如色谱柱、亲和柱品牌）时，应按照相关要求进行方法验证（如线性、回收率、精密度、检出限、定量限等）。
- 标准更新： 请注意GB标准可能存在更新，实际应用时应以最新发布的有效版本为准。
此文本严格依据GB 5009.111-2015国家标准内容整理，仅包含技术细节，不涉及任何特定企业信息。
