MRM/PRM靶向蛋白质组学：精准定量的核心技术
一、技术定义与核心区别
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MRM：多反应监测
- 在三重四极杆质谱上实现。
- 原理： 第一级四极杆选择目标肽段特定的前体离子 -> 碰撞室碎裂 -> 第三级四极杆选择该肽段特异的1-3个碎片离子进行监测。
- 核心： 基于已知的肽段序列及其碎裂特征，预设监测离子对，具有极高的选择性。
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PRM：平行反应监测
- 在高分辨率、高精度质谱仪上实现。
- 原理： 第一级质量分析器选择目标肽段的前体离子 -> 在HCD/CID碰撞池中碎裂 -> 第二级质量分析器（通常为Orbitrap）全扫描采集该前体离子产生的所有高质量精度的碎片离子谱图。
- 核心： 利用高分辨质谱的强大能力，在一次扫描中采集目标肽段的所有碎片离子信息，无需预先指定离子对。
二、标准工作流程
- 目标蛋白选择： 基于研究问题（如候选生物标志物、信号通路关键蛋白）确定目标蛋白列表。
- 肽段选择： 利用数据库工具筛选目标蛋白特有的“可观测肽段”，避开易修饰、易降解区域，优选疏水性适中的肽段。通常选择2-3条肽段/蛋白；每条肽段优选2-3个特征碎片离子用于定量。
- 方法开发与优化：
- 样品制备： 细胞/组织裂解 -> 蛋白质提取 -> 变性 -> 还原 -> 烷基化 -> 胰蛋白酶酶解 -> 脱盐。
- 色谱条件优化： 针对目标肽段优化液相梯度（通常在纳流系统中进行），确保良好分离。
- 质谱参数优化：
- MRM： 为每个目标肽段优化最佳碰撞能量、去簇电压等，建立离子对列表。
- PRM： 优化前体离子隔离窗口、目标分辨率、最大注入时间、碰撞能量等。
- 样品分析：
- 目标肽段及其同位素标记内标（若使用）上样分离。
- 质谱根据预设方法，在特定时间窗口内触发对目标前体离子的监测。
- 数据分析：
- 峰提取与积分： 提取目标碎片离子色谱峰（XIC），进行峰识别与面积积分。
- 定量： 使用内标肽段（SIS）进行精确归一化和绝对定量；或使用高丰度内源性肽段进行相对定量。
- 数据质量控制： 评估保留时间稳定性、色谱峰形、信噪比、定量重现性（CV%）、检出限/定量限（LOD/LOQ）等。
- 生物学解释： 结合实验设计进行统计分析，揭示目标蛋白的表达或修饰变化规律。
三、关键方法学要素
- 高选择性： 通过监测前体+碎片离子的组合，有效排除基质干扰。
- 高灵敏度： 聚焦监测提升离子利用率，可检测低丰度蛋白（低至ng/mL或更低）。
- 宽动态范围： 通常可达4-5个数量级。
- 精确定量： 依赖稳定同位素标记标准肽段实现绝对定量，显著提高准确性。
- 重现性好： 批内/批间CV通常可控制在15%以内。
- 方法验证： 必须严格验证方法的特异性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性等。
四、核心应用领域
- 生物标志物验证： 对发现阶段筛选出的候选标志物进行大规模临床样本验证，是转化医学的关键步骤。
- 蛋白质翻译后修饰分析： 精确定量特定蛋白的磷酸化、糖基化、乙酰化等修饰位点水平。
- 靶向通路分析： 定量研究特定信号通路中关键蛋白的表达与调控。
- 药理学研究： 监测药物靶点蛋白表达、药物代谢酶活性、药效动力学标志物变化。
- 合成生物学/蛋白质工程： 精确量化工程化蛋白的表达水平和质量属性。
五、优势与挑战
- 优势：
- 定量准确度高、重现性好。
- 灵敏度高，适用于复杂基质（如血浆、组织裂解液）。
- 通量较高，可实现数十至数百个目标蛋白的同时分析。
- 方法开发成功后易于标准化和实验室间转移。
- 挑战：
- 前期投入大： 肽段选择、方法优化、合成同位素标记肽段成本高耗时长。
- 目标限制性： 一次只能分析预设的目标列表，无法发现新目标。
- 动态范围限制： 同时分析极高和极低丰度蛋白时存在挑战。
- 通量瓶颈： 相比于DIA或非靶向DDA，目标数量仍有上限（尤其对于MRM）。
六、发展趋势
- PRM主导： 因其简化方法开发流程（无需优化离子对）、提供完整碎片谱图（增强特异性验证能力）、易于在发现平台验证等优势，应用日益广泛。
- 高分辨率MRM： 在高分辨质谱上模拟MRM扫描，结合高分辨碎片离子检测，提升选择性。
- 自动化与标准化： 开发自动化工具简化方法开发、数据分析和跨平台方法转移。
- 整合DIA策略： 探索PRM与数据非依赖性采集的结合应用。
- 深度覆盖： 提升仪器速度和灵敏度，扩展单次分析的目标蛋白数量。
- 临床应用标准化： 推动基于MRM/PRM的临床诊断标志物Panel的标准化和法规认可。
总结：
MRM和PRM靶向蛋白质组学是现代精准蛋白质定量分析的基石技术。它们凭借出色的特异性、灵敏度、准确度和重现性，在生物标志物验证、翻译后修饰研究、通路分析和药物研发等关键领域发挥着不可替代的作用。随着高分辨质谱技术的普及和方法的不断优化，尤其是PRM技术的快速发展，靶向蛋白质组学将继续为生命科学和医学研究提供强大且精准的工具。