PARP酶活性比色试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：53 作者：生物检测中心

PARP酶活性比色检测实验方案

一、 实验原理
聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）是一种关键的DNA损伤修复酶，其活性检测在癌症研究与药物开发中具有重要意义。本方案基于比色法检测PARP活性：

  1. 酶促反应： PARP催化NAD⁺的烟酰胺基水解，将ADP-核糖基团转移至自身或其他受体蛋白（如组蛋白），同时生成副产物烟酰胺（NAM）。
  2. 显色反应： 利用特定试剂将反应生成的烟酰胺（NAM）转化为显色物质（通常是甲臜类化合物）。
  3. 比色定量： 在特定波长（通常在450 nm左右可见光区）下测定显色产物的吸光度值（OD值）。该OD值与反应过程中生成的NAM量成正比，从而反映出PARP活性。
 

二、 主要试剂与材料

  • 实验缓冲液 (1X PARP Buffer):
    • Tris-HCl (pH 8.0): 50 mM
    • MgCl₂: 10 mM
    • KCl: 50 mM
    • DTT: 1 mM (临用前加入，保持还原环境)
    • Triton X-100: 0.05% (v/v) (可选，有助于裂解细胞或稳定酶)
    • (注：具体浓度可根据优化调整)
  • 激活DNA（激活剂）： 破碎鲑鱼精DNA (Activated DNA) 或特定DNA寡核苷酸片段。
  • 底物： β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (β-NAD⁺)。
  • 样品： 含PARP的细胞裂解液（需测定蛋白浓度）、纯化的PARP酶溶液、或经处理的样品溶液（注意设置对照）。
  • 显色终止试剂： 特定配方的显色试剂（通常包含显色底物、酶偶联系统等，能将NAM高效转化为显色产物并终止反应）。(注：具体配方依商业试剂盒核心组分而定，此处不赘述)
  • 终止液： 某些方案可能需要额外终止液（如强酸）。
  • 阴性对照： 不含PARP的缓冲液或失活裂解液。
  • 阳性对照： 已知活性的纯化PARP酶溶液（可选）。
  • 抑制剂对照（可选）： 使用已知的PARP抑制剂（如3-AB, Olaparib）处理样品。
  • 细胞裂解缓冲液 (RIPA或NP-40类)： 用于制备细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂和PARP抑制剂）。
  • 蛋白浓度测定试剂（如BCA法）
  • 通用耗材： 96孔平底透明酶标板、多通道移液器及吸头、离心机、恒温水浴锅或培养箱（37°C）、配备450 nm滤光片的酶标仪、微量离心管、冰盒。
 

三、 实验操作步骤

  1. 样品准备（细胞裂解液为例）：

    • 收集细胞，预冷的PBS洗涤。
    • 加入适量含蛋白酶抑制剂和PARP抑制剂的裂解缓冲液（防止提取过程中自身酶活作用），冰上裂解15-30分钟。
    • 4°C, 12000-14000 g离心15分钟。
    • 小心吸取上清（即细胞裂解液）至新离心管，置于冰上。
    • 立即测定蛋白浓度（如BCA法），并将所有样品蛋白浓度调整至一致（例如1-2 mg/mL）。用PARP缓冲液稀释。

  2. 反应体系配置与加样（在冰上操作）：

    • 在96孔板的对应孔中按以下顺序加入试剂（设3个重复孔）：
      • 背景空白孔 (Blank)： PARP缓冲液 + 激活DNA + 显色终止试剂 (提前终止，测背景)
      • 阴性对照孔 (Negative Control)： PARP缓冲液（或失活裂解液） + 激活DNA + NAD⁺ + 最后加 显色终止试剂
      • 样品孔 (Sample)： 待测样品（含PARP） + 激活DNA + NAD⁺ + 最后加 显色终止试剂
      • 阳性对照孔 (可选)： 阳性对照样品 + 激活DNA + NAD⁺ + 最后加 显色终止试剂
      • 抑制剂对照孔 (可选)： 抑制剂预处理样品 + 激活DNA + NAD⁺ + 最后加 显色终止试剂
    • 体积参考 (总反应体积通常50-100μL)：
      • PARP缓冲液：补足至所需体积
      • 激活DNA：终浓度通常5-20 μg/mL
      • NAD⁺：终浓度通常50-200 μM
      • 样品/对照：10-20 μL (根据蛋白浓度调整)
      • 关键：NAD⁺应最后加入以启动反应。

  3. 酶促反应：

    • 轻轻震荡混匀酶标板。
    • 用封板膜或盖子密封酶标板（防止蒸发）。
    • 置于37°C恒温培养箱或水浴中孵育 特定时间（通常30分钟至2小时）。(时间需预实验优化，确保反应在线性范围内)。

  4. 显色与终止反应：

    • 孵育结束后，从温箱取出酶标板。
    • 立即 向每个反应孔中加入规定体积（通常等体积于反应体系）的 显色终止试剂。
    • 用多通道移液器轻轻吹打混匀数次（避免产生气泡）。
    • (若方案要求单独终止液，则在显色前或显色后加入)
    • 室温避光放置 特定时间（通常15-60分钟），让显色反应充分进行。

  5. 比色检测：

    • 将酶标板放入酶标仪中。
    • 以 背景空白孔 调零（或读取所有孔后扣除其平均值）。
    • 在 450 nm 波长处测定各孔的吸光度值（OD<sub>450</sub>）。
    • 记录数据。
 

四、 数据处理与计算

  1. 计算平均值： 计算各组的OD<sub>450</sub>平均值（如阴性对照、各样品组等）。
  2. 扣除背景： 样品孔OD值需减去 阴性对照孔 的平均OD值 (OD_sample_corrected = OD_sample_avg - OD_NegControl_avg)。
    (背景空白孔主要用于确认显色系统本底，通常最终计算以阴性对照为本底)
  3. 计算相对活性：
    • 若需要比较不同样品间活性差异，可将处理组（样品）的OD_sample_corrected与对照组（如未处理细胞）的OD_control_corrected进行比较：
      Relative Activity (%) = (OD_sample_corrected / OD_control_corrected) × 100
    • 若绘制标准曲线（使用已知活性的PARP或已知浓度的显色物产物类似物），可根据标准曲线将OD_sample_corrected换算成绝对活性单位（如 pmol/min/mg 蛋白）。
  4. 统计与分析： 使用统计软件（如GraphPad Prism）进行t检验、ANOVA等分析，评估组间差异显著性。
 

五、 关键注意事项

  1. 样品处理： 制备细胞裂解液时务必添加蛋白酶抑制剂和PARP抑制剂，并在冰上操作，防止PARP自修饰降解及自身活化。
  2. 蛋白浓度归一化： 所有待测样品的蛋白浓度必须精确测定并调整一致，否则结果无法比较。
  3. 反应线性范围： 酶促反应时间和酶量（蛋白量）需通过预实验确定在线性范围内（即OD值与时间/蛋白浓度成正比），确保数据的准确性。孵育时间过长或酶量过高会导致底物耗尽或反应非线性。
  4. 对照设置： 严格的阴性对照（无酶活性）至关重要，用于扣除本底信号。阳性对照（已知活性酶）有助于验证实验系统有效性。抑制剂对照用于确认检测信号的特异性。
  5. NAD⁺加入时机： NAD⁺务必最后加入混合，以统一启动所有孔的反应。
  6. 温度控制： 酶促反应孵育需在精确控制的37°C环境下进行。
  7. 混匀与气泡： 加样和加终止试剂后须充分混匀，但避免产生气泡影响OD值读取。
  8. 显色时间： 加入显色终止试剂后的显色时间需严格控制一致，并在规定时间内完成读数。
  9. 酶标仪校准： 确保酶标仪波长准确且光路清洁。
  10. 试剂稳定性： NAD⁺溶液对光敏感且不稳定，需临用前配制或分装避光保存于-20°C。显色终止试剂也需按说明保存和使用。
  11. 数据重复性： 每个样本应设置至少3个重复孔，以评估实验误差。
 

六、 应用与局限性

  • 应用： 广泛用于筛选评估PARP抑制剂效力、研究DNA损伤应答机制、检测不同细胞/组织类型PARP活性差异、监测肿瘤细胞对PARP抑制剂的敏感性等。
  • 优点： 操作相对简便快捷、成本较低、通量高（96孔板）、无需放射性同位素。
  • 局限性：
    • 灵敏度可能低于基于放射性同位素（<sup>32</sup>P-NAD⁺）的方法或某些荧光法。
    • 显色反应可能受样品中复杂成分干扰（如某些还原性物质）。
    • 测量的是总PARP催化活性（主要是PARP1/2），难以区分同工酶特异性活性（需结合其他方法如WB）。
 

参考文献 (格式示例)：

  1. Putt, K. S., & Hergenrother, P. J. (2004). An enzymatic assay for poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) via the chemical quantitation of NAD⁺: Application to the high-throughput screening of small molecules as potential inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 14(6), 1475-1478.
  2. Shall, S., & de Murcia, G. (2000). Poly(ADP-ribose) polymerase-1: what have we learned from the deficient mouse model?. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 460(1), 1-15. (经典综述，包含活性检测原理背景)
  3. Banasik, M., Komura, H., Shimoyama, M., & Ueda, K. (1992). Specific inhibitors of poly(ADP-ribose) synthetase and mono(ADP-ribosyl)transferase. Journal of Biological Chemistry, 267(3), 1569-1575. (较早描述酶活检测方法)
 

本方案提供了一个PARP酶活性比色检测的通用框架。实际操作中，应根据具体实验室条件、试剂来源和实验目的进行优化和验证。务必严格遵守安全操作规程。

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