细胞焦亡LDH释放试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：48 作者：生物检测中心

细胞焦亡LDH释放试验：原理、步骤与应用

细胞焦亡（Pyroptosis）是一种由炎性半胱天冬酶（如 Caspase-1, -4, -5, -11）介导的程序性细胞死亡方式，在机体抵抗病原体感染和多种疾病（如脓毒症、动脉粥样硬化、神经退行性疾病）中发挥重要作用。其显著特征包括细胞膜形成孔道（如 Gasdermin D 蛋白介导）、细胞肿胀、内容物释放及强烈的炎症反应。乳酸脱氢酶（LDH）释放试验是检测细胞焦亡最常用、最可靠的方法之一，通过量化受损细胞释放到培养基中的LDH水平，间接反映细胞膜完整性破坏的程度。

一、 实验原理

乳酸脱氢酶（LDH）是一种广泛存在于所有有核细胞胞浆内的稳定酶。当细胞膜结构完整时，LDH被限制在细胞内。在细胞焦亡过程中，Gasdermin D 等蛋白在细胞膜上形成孔道，导致细胞膜通透性显著增加甚至完全破裂，胞浆内容物（包括LDH）大量释放到细胞外培养液中。

LDH释放试验基于LDH的酶促反应：

  1. 反应原理： LDH催化乳酸氧化生成丙酮酸，同时将氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。
    • 乳酸 + NAD⁺ → 丙酮酸 + NADH + H⁺
  2. 比色检测： 生成的NADH在另一种酶（黄递酶，Diaphorase）的作用下，能将无色的四唑盐（如碘硝基四唑紫，INT）还原为红色的甲臜（Formazan）染料。
  3. 定量分析： 甲臜染料在490-520 nm波长处有最大吸收峰。通过测定该波长下的吸光度值（OD值），即可计算出样品中LDH的活性（即浓度）。释放到培养基中的LDH活性与细胞膜损伤（即焦亡程度）成正比。
 

二、 实验材料与试剂（通用名称）

  • 细胞： 待研究的贴壁或悬浮细胞系。
  • 细胞培养设备： 细胞培养箱、生物安全柜、离心机、倒置显微镜。
  • 检测仪器： 酶标仪（配备490-520 nm滤光片）。
  • 耗材： 细胞培养板（如96孔板）、移液器及吸头、离心管。
  • 关键试剂：
    • 完全细胞培养基
    • 细胞消化液（如胰蛋白酶-EDTA溶液，用于贴壁细胞）
    • LDH释放检测试剂盒核心组分（通常包含）：
      • 裂解缓冲液（Lysis Buffer）： 用于完全裂解细胞，提供最大LDH释放值（Max Release Control）。
      • LDH检测底物混合液（Reaction Mix）： 含有乳酸、NAD⁺、INT（或类似四唑盐）、Diaphorase（或乳酸脱氢酶偶联剂）和必要的缓冲液。注意：不同试剂盒具体组分和配方可能不同。
    • 磷酸盐缓冲液（PBS）
    • （可选）细胞焦亡诱导剂（如特定病原体相关分子模式PAMPs、损伤相关分子模式DAMPs、化疗药物等）。
    • （可选）细胞焦亡抑制剂（如Caspase抑制剂、Gasdermin抑制剂等）。
 

三、 实验步骤（以96孔板为例）

  1. 细胞铺板与处理：

    • 将处于对数生长期的细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔加入适量细胞悬液（通常100 μL），使细胞在实验结束时达到合适的密度（避免过密或过稀）。
    • 将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育过夜（或指定时间），使细胞充分贴壁（贴壁细胞）或恢复状态。
    • （若需诱导焦亡）吸去旧培养基，更换为含有特定浓度诱导剂的新鲜培养基（100 μL/孔）。同时设置：
      • 空白对照组（Blank）： 仅含培养基，无细胞。用于扣除背景。
      • 自发释放组（Spontaneous Release）： 含细胞的正常培养基（不加诱导剂）。代表基础膜损伤水平。
      • 最大释放组（Maximum Release）： 含细胞的孔，加入裂解缓冲液（通常按试剂盒说明加入，如10 μL/孔），使所有细胞完全裂解，代表总LDH含量。
      • （可选）诱导剂对照组： 含诱导剂的培养基（无细胞），用于排除诱导剂本身对吸光度的干扰。
      • （可选）抑制剂组： 先用抑制剂预处理细胞，再加入诱导剂，用于验证焦亡是否被抑制。
    • （若无需诱导）直接进行下一步。
    • 将处理后的培养板放回培养箱，按实验设计孵育特定时间（如4-24小时，根据诱导剂和细胞类型确定）。

  2. 样品收集与准备：

    • 孵育结束后，小心将96孔板从培养箱中取出。
    • 对于贴壁细胞： 轻轻晃动培养板使死细胞脱落，或用移液器轻轻吹打数次（避免损伤活细胞）。此步骤对于确保释放的LDH在培养基中均匀分布很重要。
    • 将每孔上清液（约50 μL）小心转移到新的96孔板对应孔中（避免吸入细胞）。注意：此步获取的是含有释放LDH的上清样本。
    • （可选）最大释放组处理： 在原始板的“最大释放组”孔中，按试剂盒说明加入裂解缓冲液（如10 μL/孔），混匀后室温孵育指定时间（如10-30分钟）。然后同样转移50 μL上清到新板的对应孔中。

  3. LDH反应与检测：

    • 按照购买的LDH检测试剂盒说明书，在冰上或室温下配制适量的LDH检测底物混合液（Reaction Mix）。注意：避光保存，现配现用。
    • 向装有上清液样品（50 μL）的新96孔板的每个样品孔中，加入等体积（50 μL）的LDH检测底物混合液。
    • 用封板膜或盖子覆盖孔板，轻轻混匀（可在摇床上低速震荡数秒）。
    • 将孔板置于避光处，室温（或按说明书指定温度）孵育20-40分钟（具体时间需根据试剂盒说明和显色情况优化）。
    • 孵育结束后，立即在酶标仪上读取490-520 nm波长处的吸光度值（OD值）。注意：有些试剂盒推荐在加入终止液后读数，需按说明书操作。

  4. （可选）细胞活力验证： 可在转移上清后，向原始板的细胞沉淀中加入含CCK-8或MTT等试剂的培养基，进行细胞活力测定，作为LDH释放的辅助验证。

 

四、 数据处理与结果计算

  1. 计算各组平均OD值：

    • 计算自发释放组（Spontaneous）、最大释放组（Maximum）和各处理组的平均OD值。
    • 空白对照组（Blank）的平均OD值代表背景值。

  2. 计算LDH释放率（%）： 最常用的表示方法。
    LDH释放率 (%) = [(OD样本 - OD自发释放) - (OD空白)] / [(OD最大释放 - OD自发释放) - (OD空白)] × 100%

    • 解释：
      • (OD样本 - OD自发释放) - (OD空白)：代表样本中由诱导导致的额外LDH释放量（扣除自发释放和背景）。
      • (OD最大释放 - OD自发释放) - (OD空白)：代表细胞在该样本中理论上可释放的最大LDH量（扣除自发释放和背景）。
      • 比值乘以100%即得到LDH释放百分比，直观反映细胞膜损伤（焦亡）的程度。

  3. 计算特异性LDH释放：
    特异性LDH释放 = (OD样本 - OD自发释放) - (OD空白)
    该值直接反映诱导后释放的LDH绝对量。

  4. 统计分析： 使用适当的统计方法（如t检验、ANOVA）比较不同处理组之间的差异是否具有统计学意义（通常设定P<0.05为显著）。

 

五、 结果解读

  • LDH释放率显著升高（如>自发释放组的2-3倍或更高），且具有统计学意义： 强烈提示细胞发生了显著的膜损伤，结合实验条件（如使用了已知的焦亡诱导剂），可支持细胞焦亡的发生。
  • LDH释放率升高不明显或与自发释放组无显著差异： 表明细胞膜损伤轻微或未发生，可能未发生焦亡，或诱导条件不充分。
  • 使用焦亡抑制剂后，诱导剂引起的LDH释放率升高被显著抑制： 进一步证实观察到的LDH释放是由焦亡途径介导的。
 

六、 方法优势与局限性

  • 优势：
    • 操作简便快速： 步骤相对标准化，易于在普通实验室开展。
    • 灵敏度较高： 可检测到较小程度的细胞膜损伤。
    • 高通量： 适用于96孔板或384孔板，可同时检测大量样本。
    • 定量客观： 结果以吸光度值表示，便于统计分析。
    • 通用性强： 适用于多种贴壁或悬浮细胞类型。
  • 局限性：
    • 非特异性： LDH释放仅反映细胞膜完整性破坏（膜通透性增加/破裂），不能直接区分细胞焦亡与其他形式的细胞死亡（如坏死、晚期凋亡）。必须结合其他方法（如形态学观察、Caspase活化检测、Gasdermin切割检测、炎性因子释放检测等）进行综合判断。
    • 受细胞数量影响： 结果依赖于每孔细胞的数量和活性，铺板均一性很重要。
    • 自发释放干扰： 细胞在培养过程中会存在一定程度的自发LDH释放（尤其在高密度或状态不佳时），需设置对照扣除。
    • 底物毒性： 反应底物（如INT）可能对细胞有一定毒性，反应时间需严格控制。
    • 不能区分死亡模式： 无法提供关于焦亡执行分子（如Gasdermin孔道）活性的直接信息。
 

七、 实验注意事项

  1. 严格无菌操作： 避免微生物污染。
  2. 细胞状态关键： 使用状态良好、处于对数生长期的细胞。铺板密度需优化，保证实验结束时各孔细胞数量一致。
  3. 操作轻柔： 转移上清液时避免吸入细胞或产生气泡。
  4. 试剂保存与配制： 严格按照试剂盒说明书保存试剂（尤其检测底物混合液常需避光冷藏或冷冻），配制好的底物混合液尽快使用。
  5. 反应时间控制： 显色反应时间需精确，过长可能导致背景过高或超出线性范围，过短则灵敏度不足。建议在反应开始后定期监测显色情况以确定最佳时间。
  6. 避光： 显色反应过程需避光，防止甲臜染料光解。
  7. 及时读数： 反应结束后尽快读数，避免颜色变化。
  8. 设置充分对照： 空白对照、自发释放对照、最大释放对照是计算的关键。诱导剂/抑制剂对照也应根据需要设置。
  9. 排除干扰： 确保诱导剂/抑制剂本身在检测波长下无显著吸光度或自发反应。
  10. 结果验证： 务必结合至少一种其他检测细胞焦亡特异性的方法（如Western Blot检测cleaved Caspase-1/-4/-5/-11、cleaved Gasdermin D/GSDME；ELISA检测IL-1β/IL-18释放；显微镜观察焦亡形态如细胞肿胀、膜起泡、PI/Hoechst共染色等），以确认LDH释放是由焦亡引起，而非其他死亡方式。
  11. 冻存细胞： 冻存/复苏后的细胞可能自发释放LDH较高，需充分恢复后再实验。
 

结论

乳酸脱氢酶（LDH）释放试验是研究细胞焦亡过程中细胞膜损伤的重要且实用的工具。其操作简便、定量客观、通量高，能有效反映细胞膜完整性破坏的程度。然而，其固有的局限性——无法特异性区分焦亡与其他细胞死亡方式——要求研究者必须谨慎解读结果，并结合多种特异性检测方法进行综合判断。在严谨的实验设计和与其他分子生物学、形态学方法联合应用的前提下，LDH释放试验在阐明细胞焦亡机制、筛选调控焦亡的药物或因子、评估疾病模型中焦亡水平等方面，具有广泛的应用价值。

参考文献 (此处列出关键参考文献格式示例，实际需查阅具体文献)

  • Galluzzi, L., et al. (2018). Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation, 25(3), 486-541. (提供细胞死亡方式定义，包括焦亡)
  • Bergsbaken, T., Fink, S. L., & Cookson, B. T. (2009). Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nature Reviews Microbiology, 7(2), 99-109. (经典焦亡综述)
  • Decker, T., & Lohmann-Matthes, M. L. (1988). A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity. Journal of immunological methods, 115(1), 61-69. (早期LDH释放法文献)
  • 所使用的特定LDH检测试剂盒说明书。 (重要操作细节来源)
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