晚期糖基化终末产物ELISA试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：7 作者：生物检测中心

晚期糖基化终末产物（AGEs）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法

一、 引言
晚期糖基化终末产物（Advanced Glycation End products, AGEs）是还原糖（如葡萄糖、果糖）的羰基与蛋白质、脂质或核酸的游离氨基发生非酶促反应（即美拉德反应）后形成的一系列稳定且具有交联特性的复杂化合物。AGEs在体内的累积与糖尿病及其并发症（如肾病、视网膜病变、神经病变、血管病变）、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、衰老等多种慢性疾病的发生发展密切相关。因此，准确检测生物样本（如血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液等）中的AGEs含量，对于疾病机制研究、风险评估、药物筛选及疗效监测具有重要意义。酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）因其高灵敏度、高特异性、高通量和操作相对简便等优点，成为检测AGEs最为常用的方法之一。

二、 实验原理
本实验采用双抗体夹心法（Sandwich ELISA）或竞争抑制法（Competitive ELISA）。由于AGEs结构高度异质且缺乏单一明确的抗原表位，目前常用基于对AGEs共同结构表位（如羧甲基赖氨酸CML、戊糖素、吡咯素等）具有广谱或特异性的多克隆或单克隆抗体进行检测。

  • 双抗体夹心法（较常用）：
    1. 包被： 将针对AGEs表位的特异性捕获抗体预包被在96孔微孔板上。
    2. 加样与结合： 加入待测样本或标准品，样本中的AGEs与固相捕获抗体结合。
    3. 洗板去除未结合物质。
    4. 检测抗体结合： 加入生物素标记或酶标记的针对AGEs不同表位的检测抗体，形成“捕获抗体-AGEs-检测抗体”复合物。
    5. 洗板去除未结合的检测抗体。
    6. 信号放大与显色（若使用生物素标记）： 加入辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的链霉亲和素（Streptavidin），与检测抗体上的生物素结合。
    7. 洗板。
    8. 显色： 加入相应的底物溶液（如TMB for HRP, pNPP for AP），酶催化底物产生可溶性有色产物。
    9. 终止： 加入终止液（如2M H₂SO₄ for TMB）终止反应。
    10. 检测： 用酶标仪在特定波长（如450nm for TMB, 405nm for pNPP）下测定各孔的光密度（OD值）。
  • 竞争抑制法：
    1. 包被： 将AGEs抗原（如AGE-BSA）预包被在微孔板上。
    2. 加样与竞争： 同时加入待测样本（含未知量AGEs）和固定量的酶标记抗体（抗AGEs抗体）。样本中的游离AGEs与固相包被的AGEs竞争结合酶标抗体。
    3. 洗板去除未结合的酶标抗体。
    4. 显色： 加入底物显色。
    5. 终止与检测： 终止反应并读取OD值。样本中AGEs浓度越高，则与固相抗原结合的酶标抗体越少，显色越浅（OD值越低）。
 

三、 主要试剂与材料

  • 预包被微孔板： 96孔板，通常预包被捕获抗体（夹心法）或AGEs抗原（竞争法）。
  • AGEs标准品： 一系列已知浓度的AGEs溶液（通常以BSA为载体，如AGE-BSA），用于绘制标准曲线。
  • 样品稀释液： 用于稀释样品和标准品。
  • 检测抗体： 生物素标记或酶标记的抗AGEs抗体（夹心法）。
  • 洗涤缓冲液（10X或20X）： 常用含吐温-20（如0.05% Tween-20）的磷酸盐缓冲液（PBS），使用前需按说明稀释。
  • 链霉亲和素-HRP（夹心法，若使用生物素标记检测抗体）。
  • 底物溶液（TMB或其它）： 如3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）。
  • 终止液： 如2M硫酸。
  • 酶标仪： 能读取450nm（TMB）或相应波长OD值的仪器。
  • 移液器及吸头、洗板机（或手动洗板瓶）、恒温孵育箱（通常37°C）、计时器、蒸馏水或去离子水。
 

四、 实验步骤
(操作前务必仔细阅读具体试剂说明书，以下为通用流程概述)

  1. 试剂与样本准备：
    • 将所有试剂平衡至室温（约20-25°C）。
    • 将浓缩洗涤液按说明书要求稀释成工作浓度。
    • 将冻存的AGEs标准品复溶，并按要求进行系列稀释（例如：0, X, Y, Z, A, B μg/mL）。
    • 处理待测样本：
      • 血清/血浆： 新鲜采集，避免溶血。离心分离后立即分装，-80°C保存。检测前稀释（常用稀释倍数需预实验确定）。
      • 组织匀浆： 称重后加入适量匀浆缓冲液（如含蛋白酶抑制剂的PBS），冰浴匀浆。离心（如4°C，10000-15000×g, 10-20min），取上清液检测，通常需稀释。
      • 细胞上清液： 离心去除细胞碎片，直接或稀释后检测。
  2. 加样：
    • 在预包被板相应孔中加入设定浓度的标准品和已稀释的待测样本（如100μL/孔）。通常设置复孔。设置空白对照孔（只加样品稀释液）和/或零孔（标准品0浓度）。
  3. 孵育结合：
    • 封板膜覆盖板孔，按说明书要求在设定温度（通常37°C）和时间内进行孵育（如1-2小时）。
  4. 洗涤：
    • 孵育结束，揭开封板膜，甩掉孔内液体。
    • 用洗涤工作液注满每孔（通常300μL/孔），静置一定时间（如30秒至1分钟），甩净。重复洗涤3-5次。最后一次在吸水纸上拍干。
  5. 加检测抗体（夹心法）：
    • 按说明书要求稀释生物素标记或酶标记的检测抗体。加入各孔（如100μL/孔）。
    • 封板，按说明书要求孵育（如37°C, 1小时）。
  6. 洗涤： 同步骤4。
  7. 加链霉亲和素-HRP（夹心法，若使用生物素标记检测抗体）：
    • 加入适当稀释的链霉亲和素-HRP溶液（如100μL/孔）。
    • 封板，按说明书要求孵育（如37°C, 30分钟）。
  8. 洗涤： 同步骤4。（此步洗涤需彻底，避免背景高）。
  9. 显色：
    • 加入底物溶液（如TMB, 100μL/孔）。
    • 室温避光孵育设定时间（如15-30分钟）。观察标准品高浓度孔出现明显蓝色（TMB）。
  10. 终止反应：
    • 加入终止液（如2M H₂SO₄, 100μL/孔），轻轻混匀。蓝色立即变为黄色（TMB）。
  11. 检测OD值：
    • 在30分钟内（避免颜色衰减），用酶标仪在450nm波长（以630nm或空白孔作参比波长）下读取各孔OD值。
 

五、 数据处理与结果计算

  1. 计算平均OD值： 计算标准品各浓度点及待测样本复孔的平均OD值。
  2. 绘制标准曲线：
    • 以标准品浓度的对数值（log₁₀）为横坐标（X轴），对应的平均OD值（或OD值减去零孔OD值）为纵坐标（Y轴）。
    • 使用四参数逻辑回归（4-Parameter Logistic, 4PL）曲线拟合通常能获得最佳拟合效果（R² > 0.99）。线性回归也可用于线性范围好的曲线。
  3. 计算样本浓度：
    • 根据待测样本的平均OD值（或减去零孔OD值），利用拟合好的标准曲线方程计算出其对应的浓度（X值）。
    • 注意：由于样本在检测前进行了稀释，计算出的浓度需要乘以相应的稀释倍数，才能得到原始样本中的实际AGEs浓度（例如：μg/mL血清，或μg/mg组织蛋白）。
  4. 单位： 结果通常表示为μg/mL（体液）或μg/mg蛋白（组织匀浆）。组织样本需提前测定蛋白浓度（如BCA法）进行校正。
 

六、 质量控制与注意事项

  • 标准曲线： R²值应≥0.99，表明拟合良好。标准品点应均匀分布在曲线上。
  • 精密度：
    • 板内精密度（重复性）： 同一样本在同一块板内多次测量的变异系数（CV%）应<10%。
    • 板间精密度（重现性）： 同一样本在不同批次实验中测量的CV%应<15%。
  • 准确性（回收率）： 向已知浓度样本中添加低、中、高浓度标准品，测定回收率，应在80%-120%范围。
  • 灵敏度（检出限LoD）： 通常定义为零孔OD值均值加上其2或3倍标准差所对应的浓度。
  • 特异性： 抗体是关键。了解所用抗体识别的AGEs主要类型（如CML、戊糖素特异性或广谱性）。
  • 背景控制： 空白孔OD值应尽可能低。彻底洗涤是降低背景的关键步骤。
  • 样本处理： 避免反复冻融。溶血、脂血可能干扰结果。组织匀浆要充分，离心去除杂质。细胞上清液避免污染。
  • 操作规范： 精确移液，严格控制孵育时间和温度，充分洗涤。
  • 干扰因素： 某些药物或高浓度物质可能产生干扰。
  • 批次差异： 不同批次试剂盒可能存在差异，应避免混用批次。
 

七、 应用与展望
AGEs ELISA作为一种成熟的工具，广泛用于：

  • 评估糖尿病患者血糖长期控制水平及并发症风险。
  • 研究衰老过程中AGEs的累积机制。
  • 探索AGEs在心血管疾病、神经退行性疾病、肾病等发病中的作用。
  • 评价具有抗糖化作用的药物、功能食品或天然产物的效果。
    未来发展方向包括开发针对特定单一毒性AGEs（如CML、CEL、MGO-H1）的高特异性单克隆抗体及ELISA试剂盒，提高检测的通量和自动化程度，以及实现更低样本量的检测（如适用于微量组织样本）。
 

八、 参考文献

  1. Singh, R., Barden, A., Mori, T., & Beilin, L. (2001). Advanced glycation end-products: a review. Diabetologia, 44(2), 129-146.
  2. Thornalley, P. J. (2005). Measurement of protein glycation, glycated peptides, and glycation free adducts. Peritoneal Dialysis International, 25(Suppl 3), S35-S40.
  3. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) guide. Nature Methods (or relevant antibody/assay provider’s technical documentation - generic principles).
 

说明： 本文提供的是晚期糖基化终末产物（AGEs）ELISA检测的通用原理、步骤和注意事项。实际操作必须以所使用的具体试剂盒说明书为准进行调整。实验结果的解读需结合具体的研究背景和临床情况。

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