双荧光素酶检测

发布时间：2025-06-13 17:14:48 阅读量：5 作者：生物检测中心

双荧光素酶检测技术：原理、流程与应用

双荧光素酶报告基因检测系统是现代分子生物学中一项精密的基因表达调控研究工具，尤其擅长分析启动子活性、microRNA靶向作用以及信号通路应答元件等功能。其核心优势在于利用双报告基因实现实验信号的内参校正，显著提升结果的准确性和可靠性。

核心原理：双报告基因协同校正

  1. 主报告基因：萤火虫荧光素酶

    • 来源： 北美萤火虫（Photinus pyralis）。
    • 功能： 作为实验研究的核心指标。将感兴趣的调控序列（如启动子、3'UTR等）插入其上游或下游。目标调控元件的活性强弱直接决定萤火虫荧光素酶的表达水平。
    • 底物： D-荧光素（D-Luciferin）。
    • 发光特性： 催化D-荧光素反应产生黄绿色光（波长~560 nm），该反应需要氧气、ATP和镁离子参与。

  2. 内参报告基因：海肾荧光素酶

    • 来源： 海肾（Renilla reniformis）。
    • 功能： 作为实验系统误差的校正基准。通常由组成型启动子（如CMV, SV40）驱动表达，理论上其表达水平在样本间保持恒定。
    • 底物： 腔肠素（Coelenterazine）。
    • 发光特性： 催化腔肠素反应产生蓝光（波长~480 nm），该反应仅需氧气。

  3. 比值法读数：消除系统误差

    • 在同一个细胞样本中，萤火虫荧光素酶表达的差异由目标调控元件决定。
    • 海肾荧光素酶的表达作为内参，可校正由细胞数量差异、转染效率波动、细胞活性变化以及裂解效率不一致等因素带来的系统性误差。
    • 最终活性 = 萤火虫荧光素酶活性 / 海肾荧光素酶活性。通过计算这个比值，研究者获得经过归一化的、反映目标调控元件真实活性的数据。

标准实验流程

  1. 载体构建：

    • 将目标调控序列（如启动子片段、含有预测miRNA结合位点的3'UTR片段等）克隆至萤火虫荧光素酶报告基因的上游或下游。
    • 将海肾荧光素酶报告基因置于组成型强启动子控制下，构建于同一载体（双顺反子）或单独共转染载体中。

  2. 细胞转染：

    • 将构建好的报告基因载体（萤火虫荧光素酶 + 目标序列）和内参报告基因载体（海肾荧光素酶）共转染至目标细胞系（如HEK293T, HeLa等）。
    • 通常设置阴性对照（如空载体、突变的目标序列等）和阳性对照（如已知强启动子）。
    • 如需研究刺激或抑制效应，可在转染后特定时间点加入处理因子（如药物、细胞因子）。

  3. 细胞培养与裂解：

    • 细胞在适宜条件下培养一定时间（通常24-72小时），使报告基因充分表达。
    • 吸除培养液，加入特制的细胞裂解缓冲液裂解细胞，释放胞内荧光素酶蛋白。

  4. 荧光素酶活性检测：

    • 将细胞裂解液转移至检测板孔中。
    • 第一步： 向裂解液中加入萤火虫荧光素酶特异性底物（D-荧光素溶液），立即在化学发光检测仪上测量萤火虫荧光素酶产生的黄绿色光强度（通常测量数秒至数秒的积分值）。
    • 第二步： 向同一反应孔中加入海肾荧光素酶检测试剂（淬灭萤火虫反应并提供腔肠素），立即测量海肾荧光素酶产生的蓝光强度。商业化试剂通常包含优化的缓冲液确保两步反应互不干扰。

  5. 数据分析：

    • 记录每个样本的萤火虫荧光素酶读数（RLU₁）和海肾荧光素酶读数（RLU₂）。
    • 计算每个样本的校正比值：校正荧光素酶活性 = RLU₁ / RLU₂。
    • 将实验组的校正比值与对照组（如空载体对照或未处理组）的校正比值进行比较，通常表示为相对荧光素酶活性（Fold Change）。
    • 进行统计学分析（如Student's t检验、ANOVA）判断差异显著性。

关键优势

  1. 高灵敏度： 荧光素酶催化化学发光反应可将信号放大数百万倍，极微量表达即可检测。
  2. 高信噪比： 哺乳动物细胞自身几乎没有背景荧光素酶活性。
  3. 宽动态范围： 可检测跨越数个数量级的表达差异。
  4. 快速便捷： 检测过程自动化程度高，结果获取快。
  5. 精准归一化： 双报告设计有效消除了实验操作引入的变量误差，提供高度可靠的相对活性数据。

典型应用领域

  1. 启动子/增强子活性分析： 鉴定特定序列是否具有调控功能，确定核心功能区段，研究转录因子结合与调控机制。
  2. microRNA靶基因验证：
    • 将预测的miRNA靶序列（常位于3'UTR）克隆至萤火虫荧光素酶基因下游的3'UTR区域。
    • 共转染该报告基因载体与目标miRNA（模拟物或抑制剂）。
    • 若miRNA确实靶向该序列，则萤火虫荧光素酶活性显著降低。
  3. 信号通路研究： 构建含有特定信号通路应答元件（如NF-κB RE, AP-1 binding site）的报告基因，检测信号通路激活剂或抑制剂对该元件的调控作用。
  4. 药物筛选： 高通量筛选影响特定基因启动子活性或信号通路活性的化合物。
  5. 基因调控元件功能研究： 分析沉默子、绝缘子等其他调控元件的功能。
  6. 蛋白质-蛋白质相互作用： 结合分裂荧光素酶互补等技术进行检测。

优化与注意事项

  • 载体选择： 确保海肾荧光素酶由强组成型启动子驱动，其表达应在不同处理组间保持稳定。若研究启动子，需避免内参启动子受相同因素调控。
  • 细胞类型： 选择转染效率高且背景低的细胞系。
  • 转染优化： 优化萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶载体的共转染比例和总量（通常1：5到1：10），确保海肾信号适中且稳定。
  • 裂解与检测： 裂解需彻底，检测操作需迅速规范。底物应新鲜配制或避光保存。检测仪器需校准。
  • 海肾荧光素酶的敏感性： 海肾荧光素酶对温度变化敏感（高于室温易失活），裂解和检测最好在室温下快速完成。
  • 重复实验： 生物学重复和技术重复对于获得可靠结论至关重要。

总结

双荧光素酶报告基因检测系统凭借其灵敏度高、背景低、内参校正可靠和操作便捷等核心优势，已成为探索基因转录调控机制不可或缺的标准化工具。尤其在启动子功能解析、microRNA靶点验证及信号通路应答研究方面应用极为广泛。深入理解其原理并严格优化实验步骤，是获取可信数据、揭示复杂基因调控网络奥秘的关键。

核心参考文献：

  • Promega Corporation. (1996). Dual-Luciferase® Reporter Assay System Technical Manual. (注意：此处仅作为技术标准参考，不涉及具体产品推荐)
  • Thorne, N., Inglese, J., & Auld, D. S. (2010). Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chemistry & biology, 17(6), 646–657.
  • Alam, J., & Cook, J. L. (1990). Reporter genes: Application to the study of mammalian gene transcription. Analytical biochemistry, 188(2), 245–254.