一氧化氮合成酶Griess法试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：305 作者：生物检测中心

一氧化氮合成酶活性检测：Griess法实验方案

一、 引言
一氧化氮（NO）作为一种重要的气体信号分子，在心血管、神经、免疫系统调节中发挥关键作用。一氧化氮合成酶（NOS）是催化L-精氨酸生成NO和L-瓜氨酸的关键酶。准确测定NOS活性对于研究其生理病理功能至关重要。Griess法是一种基于比色原理、操作简便、成本低廉且广泛应用的间接检测NOS活性的经典方法。其核心原理是检测NOS催化反应中稳定的终产物——亚硝酸根离子（NO₂⁻）。

二、 实验原理

  1. NOS催化反应： NOS 催化 L-精氨酸 和 氧气，在辅因子（如NADPH、FAD、FMN、四氢生物蝶呤、Ca²⁺/钙调蛋白）存在下，生成 NO 和 L-瓜氨酸。
  2. NO转化： 在含氧水溶液中，NO 迅速被氧化成亚硝酸根离子（NO₂⁻）和硝酸根离子（NO₃⁻）。NO₂⁻ 是 Griess 法检测的主要目标物。
  3. Griess反应：
    • 亚硝酸根离子（NO₂⁻）在酸性条件下（通常由磺胺提供）与对氨基苯磺酰胺（Sulfanilamide）反应，生成重氮盐。
    • 重氮盐随后与N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐（NED）偶联，形成稳定的、水溶性的粉红色偶氮染料。
    • 该染料在540 nm波长附近具有最大吸收峰。
  4. 定量基础： 生成的偶氮染料的浓度（即吸光度值）与反应体系中亚硝酸根离子（NO₂⁻）的浓度成正比。通过测定540 nm处的吸光度，并与已知浓度的亚硝酸钠（NaNO₂）标准曲线进行比较，即可计算出样品中NO₂⁻的浓度，从而间接反映NOS的活性（通常表示为生成NO₂⁻的速率，如 nmol NO₂⁻/min/mg蛋白）。

三、 实验材料与试剂

  • 样品： 待测的组织匀浆、细胞裂解液或纯化的NOS酶液（需含有NOS活性）。
  • 主要试剂：
    • 反应缓冲液（pH 7.4）： 如50 mM Tris-HCl缓冲液（含1-5 mM CaCl₂，适用于cNOS），或含相应辅因子的缓冲液（具体根据NOS亚型调整）。
    • L-精氨酸溶液： 终浓度通常为0.1-1 mM（溶于反应缓冲液）。
    • NADPH溶液： 终浓度通常为0.1-1 mM（溶于反应缓冲液或水，临用前配制）。
    • Griess试剂：
      • 溶液A（磺胺溶液）： 1-2% (w/v) 对氨基苯磺酰胺溶解于适量的酸性溶液（如2-5%磷酸或盐酸水溶液）。
      • 溶液B（NED溶液）： 0.1-0.2% (w/v) N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐溶解于水。
      • （注：溶液A和B可等体积混合后作为单一Griess试剂使用，或分开保存，临用前混合或依次加入）。
    • 亚硝酸钠（NaNO₂）标准溶液（1 mM）： 准确称取NaNO₂溶于无离子水，配制成1 mM母液，再梯度稀释成不同浓度（如0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μM）的标准工作液。（注：标准曲线范围需覆盖预期样品浓度）。
    • 终止液（可选）： 用于终止酶反应，如含EDTA的缓冲液（螯合Ca²⁺抑制cNOS）。
    • 蛋白浓度测定试剂： 如BCA法或Bradford法所需试剂。
  • 设备：
    • 恒温水浴箱或培养箱（37°C）
    • 离心机
    • 酶标仪或分光光度计（能读取540 nm吸光度）
    • 移液器及配套吸头
    • 96孔酶标板或比色皿
    • 涡旋混合器
    • 计时器
 

四、 实验步骤

  1. 样品制备：

    • 组织样品：用预冷的匀浆缓冲液（常含蛋白酶抑制剂）制备匀浆，离心（如10,000-15,000 g, 4°C, 15-30 min），取上清液作为待测样品。
    • 细胞样品：裂解细胞，离心去除碎片，取上清液作为待测样品。
    • 测定所有待测样品（包括空白和标准品）的蛋白浓度（如BCA法），用于后续计算比活性。

  2. NOS酶促反应：

    • 在反应管（或酶标板孔）中依次加入：
      • 适量体积的反应缓冲液（补充至所需终体积）。
      • 待测样品（含蛋白量通常为10-100 μg，需预实验优化）。
      • L-精氨酸溶液（达到所需终浓度）。
      • NADPH溶液（达到所需终浓度）。
      • （根据需要加入其他必需辅因子）。
    • 设置反应对照：
      • 样品空白（本底对照）： 除不加NADPH外，其他成分相同（或用等体积缓冲液代替）。用于扣除样品本身可能存在的亚硝酸盐或干扰物。
      • 无底物对照（可选）： 不加L-精氨酸（用等体积缓冲液代替），用于评估非底物依赖的NO产生（通常很低）。
      • 无酶对照（试剂空白）： 用等体积缓冲液代替样品，其他成分相同。用于扣除试剂背景。
    • 轻柔混匀，启动反应：将反应管/板置于37°C水浴或培养箱中孵育一定时间（通常30-60分钟，需预实验确定线性反应时间）。
    • 终止反应：达到预定时间后，立即加入终止液（如含EDTA的缓冲液）终止反应，或直接进行下一步。（若Griess试剂酸性足够强，有时可省略专门终止步骤）。

  3. Griess显色反应：

    • 取等体积（如50-100 μL）的上述反应终止液（或直接取反应混合液）加入到新的96孔板孔或比色皿中。
    • 加入等体积的新鲜配制的Griess试剂（或依次加入等体积的溶液A和溶液B）。例如，加入100 μL样品液，则加入100 μL Griess试剂。
    • 立即用移液器吹打或涡旋充分混匀。
    • 室温（20-25°C）避光静置孵育10-30分钟，使显色反应充分完成（粉红色达到稳定）。（避免光照导致褪色）。

  4. 吸光度测定：

    • 使用酶标仪或分光光度计，在540 nm波长处测定各孔（或比色皿）的吸光度（OD₅₄₀）。

  5. 标准曲线制作：

    • 取不同浓度（如0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μM）的亚硝酸钠（NaNO₂）标准工作液，按照步骤3和4进行显色和测定OD₅₄₀。
    • 以NaNO₂标准品浓度（μM）为横坐标（X），对应的平均OD₅₄₀值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。通常得到一条通过原点或接近原点的直线，线性回归得到方程 Y = kX + b。
 

五、 数据处理与计算

  1. 计算反应产生的NO₂⁻浓度：
    • 根据标准曲线方程（Y = kX + b），将各样品的OD₅₄₀值（Y）代入方程，解出对应的NO₂⁻浓度（X，单位为μM）。需减去相应的对照值：
      • 净样品OD： 样品管OD₅₄₀ - 样品空白管OD₅₄₀
      • 净NOS产生的NO₂⁻浓度： 根据净样品OD计算出的浓度（μM） - 根据无酶对照OD计算出的浓度（μM）（若试剂空白显著）。
  2. 计算NOS活性：
    • 将净NOS产生的NO₂⁻浓度（μM）转换为摩尔数：
      生成的NO₂⁻摩尔数 = (净NO₂⁻浓度 × 10⁻⁶ mol/L) × 反应总体积 (L)
      • 净NO₂⁻浓度：步骤1计算出的浓度（单位μM，即10⁻⁶ mol/L）
      • 反应总体积：酶促反应体系的最终体积（单位升L）
    • 计算反应速率（单位时间生成的NO₂⁻摩尔数）：
      反应速率 (mol/min) = 生成的NO₂⁻摩尔数 / 反应时间 (min)
    • 计算比活性（最常用表示方式）：
      NOS比活性 (nmol/min/mg protein) = [反应速率 (mol/min) × 10⁹ (nmol/mol)] / 反应体系中总蛋白量 (mg)
      • 反应体系中总蛋白量：加入反应体系中的样品所含的蛋白质量（mg），由步骤1的蛋白浓度测定结果计算得出。
    • 简化计算： 由于标准曲线浓度单位常用μM，反应体积常用mL，蛋白量常用μg，常用简化公式：
      NOS比活性 (nmol/min/mg protein) = [ (净NO₂⁻浓度 (μM) × 反应总体积 (mL) ) / 反应时间 (min) ] / 反应体系蛋白量 (mg)
      • 注意：此公式中净NO₂⁻浓度单位μM（等同于nmol/mL），乘以体积mL后即为nmol。再除以时间(min)和蛋白量(mg)，即得nmol/min/mg protein。
 

六、 注意事项

  1. 避免污染： 实验用水（推荐无离子水或超纯水）、试剂和器皿必须清洁，避免外源性亚硝酸盐污染。避免使用金属器皿接触Griess试剂。
  2. 试剂稳定性： NED溶液对光敏感，需避光保存（棕色瓶或铝箔包裹）。Griess试剂（尤其混合液）稳定性有限，建议新鲜配制或验证有效期。
  3. 反应线性： 必须确保酶促反应在测定的时间范围内处于线性期（产物生成量与时间成正比）。需通过预实验确定最佳孵育时间和样品蛋白量。
  4. 样品处理： 组织/细胞样品制备需在冰上进行，使用含蛋白酶抑制剂的缓冲液，尽快测定或分装冻存于-80°C（反复冻融会降低活性）。
  5. 对照设置： 严谨设置样品空白（无NADPH）和无酶对照（试剂空白）至关重要，以扣除背景干扰。
  6. 显色条件： 显色时间和温度需保持一致，确保显色完全且稳定。显色后应在30-60分钟内完成测定，避免沉淀或褪色。
  7. NOS亚型特异性： 实验条件（如缓冲液成分、Ca²⁺浓度）应根据研究的NOS亚型（nNOS, eNOS, iNOS）进行优化。例如，检测iNOS时缓冲液通常不含Ca²⁺/钙调蛋白。
  8. 硝酸盐还原（可选）： Griess法仅检测NO₂⁻。反应中产生的NO₃⁻（比例因条件而异）无法被检测。若需测定总NOx（NO₂⁻ + NO₃⁻），可在显色前加入硝酸盐还原酶（或化学还原剂如镉柱、钼酸铵）将NO₃⁻还原为NO₂⁻再进行Griess检测。这通常称为“硝酸盐还原法”或“总NOx检测”。
  9. 干扰物质： 某些物质（如高浓度磷酸盐、硫酸盐、硫化物、抗坏血酸等）可能干扰Griess反应或酶活性，需评估其影响。
 

七、 结论
Griess法是一种可靠、经济、高通量（尤其结合酶标板）的NOS活性检测方法。通过优化实验条件、严格设置对照、规范操作流程并仔细进行数据处理，可以获得准确反映NOS酶活性的结果。该方法广泛应用于基础研究、药物筛选和临床样本分析中，为探索NO信号通路的调控机制提供了重要的技术支持。理解其原理和潜在局限性（如仅检测NO₂⁻，受干扰物影响）对于正确解释实验结果至关重要。

参考文献 (示例格式，具体引用需根据实际文献)

  1. Green, L. C., et al. (1982). Analysis of nitrate, nitrite, and [¹⁵N]nitrate in biological fluids. Analytical Biochemistry, 126(1), 131–138. (经典原始文献)
  2. Knowles, R. G., & Moncada, S. (1994). Nitric oxide synthases in mammals. Biochemical Journal, 298(Pt 2), 249–258. (NOS综述)
  3. Moshage, H., et al. (1995). Nitrite and nitrate determinations in plasma: a critical evaluation. Clinical Chemistry, 41(6 Pt 1), 892–896. (方法评价与注意事项)
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