活性氧DCFH-DA荧光试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：434 作者：生物检测中心

活性氧检测：DCFH-DA荧光探针法

一、原理

2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）是目前应用最广泛的细胞内活性氧（ROS）检测探针之一。其检测原理基于以下步骤：

  1. 跨膜进入： DCFH-DA 分子具有脂溶性，可自由穿透完整的活细胞膜进入胞内。
  2. 酯酶水解： 细胞内的酯酶将 DCFH-DA 水解，脱去其上的两个乙酸基团（-DA），生成亲水性的、带负电荷的 2’,7’-二氯二氢荧光素（DCFH）。此时的 DCFH 不发荧光，并且由于其亲水性，被“困”在细胞质内，无法自由扩散出细胞。
  3. ROS氧化： DCFH 本身是一种还原态分子，不具有荧光。当细胞内存在 ROS（如 H₂O₂, •OH, ONOO⁻, RO• 等）时，DCFH 被氧化。
  4. 荧光产生： 氧化后的产物是 2’,7’-二氯荧光素（DCF）。DCF 是一种强荧光物质，在最大激发波长 ~488 nm （常用蓝光或氩激光激发）的光激发下，发出最大发射波长 ~525 nm 的 绿色荧光。
  1. 定量检测： 细胞内产生的绿色荧光的强度与 ROS 的水平成正比。通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测该荧光信号，即可相对定量或比较不同条件下细胞内 ROS 的水平

二、实验材料与试剂

  • DCFH-DA 粉末（避光保存于 -20°C）
  • 高质量无水二甲基亚砜（DMSO）
  • 无血清细胞培养基（如 DMEM, RPMI 1640）或磷酸盐缓冲液（PBS，无钙镁离子）、Hanks’平衡盐溶液（HBSS）
  • 待检测的细胞（贴壁或悬浮）
  • 阳性对照试剂（如 H₂O₂、甲萘醌/维生素K3、抗霉素A等）
  • 阴性对照/空白对照（不加探针或不加刺激）
  • 抗氧化剂（如 N-乙酰半胱氨酸 NAC、维生素C等，可选用于抑制实验）
  • 胰蛋白酶（用于贴壁细胞消化）
  • 细胞培养相关的耗材（培养皿/板、离心管、移液器等）
  • 主要仪器：
    • 荧光显微镜 或 共聚焦显微镜（用于观察细胞内荧光分布）
    • 流式细胞仪（FCM，用于定量分析细胞群体ROS水平）
    • 荧光酶标仪（用于96/384孔板整孔荧光强度检测）
 

三、实验步骤（以贴壁细胞在96孔板中用酶标仪检测为例）

  1. 细胞准备与处理：

    • 将细胞接种到黑色壁/透明底或全黑色的96孔培养板中，使其在实验时达到合适的密度（通常70-80%融合）。
    • 按实验设计进行所需处理（如药物处理、刺激处理、基因操作等）。

  2. 探针装载：

    • 配制DCFH-DA储存液： 将 DCFH-DA 粉末用无水 DMSO 溶解，配制成高浓度储存液（如 10-20 mM）。分装避光保存于 -20°C，避免反复冻融。
    • 配制工作液： 实验前，将储存液用预热（37°C）的、不含血清的培养基（或 PBS/HBSS）稀释至所需工作浓度（通常为 5-20 μM，具体浓度需根据细胞类型和实验条件优化确定）。剧烈涡旋混匀。注意：工作液需现配现用，避光。
    • 装载探针：
      • 移除细胞培养孔中的完全培养基。
      • 用预热的 PBS 或 HBSS（无血清）轻柔洗涤细胞 1-2 次，去除残留血清（血清中含酯酶）。
      • 向每孔加入适量体积（如 100 μL）的 DCFH-DA 工作液。
      • 将细胞培养板放入 37°C、5% CO₂ 培养箱中避光孵育 20-45 分钟（时间需优化，通常30分钟）。
      • 关键：全程避光操作！

  3. 去除多余探针并平衡：

    • 孵育结束后，小心吸弃含有探针的溶液。
    • 用预热的 PBS 或 HBSS（无血清）轻柔洗涤细胞 2-3 次，彻底去除未进入细胞和残留在胞外的 DCFHDA/DCFH。
    • 向每孔加入新鲜的、不含血清的培养基（或 PBS/HBSS）100-200 μL（体积需与后续检测匹配）。将培养板放回 37°C、5% CO₂ 培养箱中避光平衡 15-30 分钟。此步骤有助于让细胞恢复稳态，降低背景荧光。

  4. 给予刺激（如需要）与荧光检测：

    • 基线检测（可选）： 在加入刺激物之前，用荧光酶标仪进行一次快速检测（激发 ~485 nm，发射 ~530 nm），记录初始荧光值（F0）。
    • 给予刺激： 向相应孔中加入预热的刺激物（如 H₂O₂）或对照溶液。轻柔混匀（避免吹打细胞）。
    • 实时/终点检测：
      • 实时检测： 立即将培养板放入预热至 37°C 的荧光酶标仪中（或带有温控功能的显微镜/流式上样台），设置程序进行多次循环检测（间隔时间如 5-30 分钟），持续监测一段时间（如 1-2 小时）内的荧光强度变化。
      • 终点检测： 将培养板放回 37°C、5% CO₂ 培养箱中避光孵育一定时间（如 30 分钟、1 小时，需优化）。孵育结束后，取出培养板，立即进行荧光检测（激发 ~485 nm，发射 ~530 nm）。
    • 关键：检测过程中保持温度（37°C），并确保避光。

  5. 数据分析：

    • 基线校准（若测了F0）： 荧光变化率 = (F - F0) / F0 或 F / F0 (F为某时间点或终点荧光值)。
    • 终点比较： 直接比较不同处理组在同一时间点的平均荧光强度（RFU）。
    • 统计学处理： 数据通常表示为 Mean ± SD/SEM。使用适当的统计方法（如 t检验、ANOVA）比较组间差异的显著性（p<0.05）。
 

四、注意事项与常见问题

  1. 避光！避光！避光！ 探针溶液配制、装载、洗涤、孵育和检测全程需严格避光，光照会导致探针提前氧化产生假阳性。
  2. 探针浓度与装载时间优化： 过高浓度或过长装载时间可能导致细胞毒性（探针本身或被氧化产物引起）或荧光饱和。需针对具体细胞类型和实验体系进行预实验优化。
  3. 血清干扰： 装载探针时必须使用无血清缓冲液（培养基/PBS/HBSS），因为血清中的酯酶会水解胞外的DCFH-DA，产生无法进入细胞的DCFH，并被氧化成DCF，导致极高的背景荧光。
  4. 洗涤充分： 装载后的洗涤步骤至关重要，必须彻底去除胞外未进入的探针及其水解/氧化产物，否则背景极高。
  5. 细胞状态： 确保细胞状态良好，处理条件（如药物浓度、刺激强度）不会导致细胞大量死亡。死细胞会非特异性地摄取探针并产生荧光，造成假阳性。可通过台盼蓝染色测定细胞活力或PI/7-AAD等染料在流式上圈门时排除死细胞。
  6. 光漂白： DCF荧光在激发光照射下会发生漂白（荧光减弱）。检测时应尽量缩短曝光时间（显微镜）或减少检测次数（实时检测），使用相同的仪器参数。
  7. 氧化产物稳定性： DCF一旦形成相对稳定，但强还原剂环境可能使其部分还原失去荧光。
  8. 阳性与阴性对照：
    • 阳性对照： 必须设置。常用合适浓度的H₂O₂ (如50-200 μM) 或甲萘醌 (如10-50 μM) 处理细胞，验证探针和实验体系的有效性。
    • 阴性对照： 包括未加探针的细胞（检测自发荧光）、仅加探针未加刺激的细胞（基础ROS水平）、以及使用抗氧化剂预处理再加刺激的细胞（验证ROS特异性）。
  9. 特异性局限： DCFH主要对 H₂O₂, •OH (羟基自由基), ONOO⁻ (过氧亚硝基阴离子), RO• (烷氧自由基) 等有反应性，对超氧阴离子 (O₂•⁻) 的直接反应性较弱。它反映的是细胞内总的氧化应激水平，而非某种特定的ROS。需要更特异探针（如DHE/O₂•⁻, HPF/•OH, Amplex Red/H₂O₂）来区分特定ROS。
  10. 光敏化： 检测过程中激发光照射本身可能诱导细胞产生ROS（尤其是使用显微镜长时间观察时），需注意控制。
  11. 仪器校准： 确保荧光检测仪器（显微镜、流式、酶标仪）各通道工作正常，激发/发射滤光片设置正确。
  12. 数据标准化： 若细胞数量或状态有差异，可尝试用蛋白浓度（BCA法）、细胞核染料（如Hoechst）荧光等对荧光强度进行归一化处理。
 

五、优缺点

  • 优点：
    • 操作相对简便。
    • 适用于多种仪器（显微镜、流式、酶标仪）。
    • 可进行动态实时监测。
    • 灵敏度较高（细胞水平）。
    • 应用广泛，技术成熟。
  • 缺点：
    • 探针本身或被氧化产物可能有一定细胞毒性。
    • 存在光漂白问题。
    • 对特定ROS选择性不高（反映总氧化应激）。
    • 背景荧光控制要求高（血清干扰、洗涤不彻底）。
    • 光照可能诱导假阳性。
    • DCFH也可能被细胞内某些氧化酶（如过氧化物酶）直接氧化，不完全依赖ROS。
 

六、总结

DCFH-DA荧光探针法是检测细胞内活性氧（ROS）水平的一种经典且实用的方法。其原理基于探针被细胞内酯酶水解后，被ROS氧化生成荧光产物DCF。通过严格控制实验条件（尤其避光和无血清装载），优化探针浓度与时间，设置合理的对照，并结合适当的检测仪器（显微镜观察分布、流式定量群体、酶标仪高通量），该方法可以有效地反映细胞内氧化应激状态的变化。然而，研究者需充分了解其局限性（如选择性不高、光漂白、潜在毒性），并结合其他特异性探针或方法以获得更精确的信息。

参考文献（示例）：

  • LeBel, C. P., Ischiropoulos, H., & Bondy, S. C. (1992). Evaluation of the probe 2',7'-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress. Chemical research in toxicology, 5(2), 227–231.
  • Kalyanaraman, B., Darley-Usmar, V., Davies, K. J., Dennery, P. A., Forman, H. J., Grisham, M. B., ... & Freeman, B. A. (2012). Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free radical biology & medicine, 52(1), 1–6.
  • Gomes, A., Fernandes, E., & Lima, J. L. (2005). Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of biochemical and biophysical methods, 65(2-3), 45–80.
 

注意： 在实际撰写正式文章时，需根据具体实验设计填充细节（如细胞类型、具体处理、浓度、时间、仪器型号与参数等），并引用更具体和最新的相关文献。

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