谷胱甘肽过氧化物酶NADPH试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：11 作者：生物检测中心

谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）NADPH消耗试验详解

一、 引言

谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GPx）是生物体内关键的抗氧化酶之一，广泛存在于各种组织细胞中。其主要功能是利用还原型谷胱甘肽（GSH）作为还原底物，催化还原过氧化氢（H₂O₂）以及有机氢过氧化物（ROOH），将其转化为无害的水或醇，从而保护细胞膜、蛋白质和核酸等重要生物大分子免受氧化损伤。GPx活性与机体抗氧化能力、抵御氧化应激以及多种疾病（如心血管疾病、神经退行性疾病、癌症等）的发生发展密切相关。

准确测定GPx活性对于评估生物体的氧化还原状态和健康状况至关重要。NADPH消耗试验是最常用和最经典的GPx活性测定方法之一，其原理基于酶促反应过程中伴随的NADPH氧化速率。

二、 实验原理

NADPH消耗试验的本质是测量GPx催化整个反应体系中NADPH的氧化速率。该速率与GPx活性成正比。整个反应体系包含两个紧密偶联的反应：

  1. GPx催化的主反应：
  
 
 
 
ROOH (有机氢过氧化物，如叔丁基过氧化氢或枯烯过氧化氢) + 2GSH → ROH + H₂O + GSSG (氧化型谷胱甘肽)
 
 
 
GPx催化有机氢过氧化物（ROOH）被2分子还原型谷胱甘肽（GSH）还原生成相应的醇（ROH）和水（H₂O），同时生成1分子氧化型谷胱甘肽（GSSG）。

2. 谷胱甘肽还原酶（GR）催化的辅助反应：

 
 
 
GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺
 
 
 
为了维持反应体系中GSH的浓度，需要加入谷胱甘肽还原酶（GR）和其辅因子NADPH。GR利用NADPH作为还原剂，将上一步生成的GSSG迅速还原回2分子GSH，同时NADPH被氧化成NADP⁺。

核心关联：
在GPx和GR的共同作用下，每当GPx催化一分子ROOH还原时，就需要消耗一分子NADPH来还原生成的GSSG（因为1分子GSSG需要1分子NADPH来还原）。因此，NADPH消耗的速率（通过监测340 nm处吸光度的下降速率ΔA₃₄₀/min来表示）直接反映了GPx的催化活性。

三、 实验材料与试剂

  • 样品： 组织匀浆上清液、细胞裂解液、血清、血浆等（需预先测定蛋白浓度）。
  • 关键试剂：
    • 磷酸盐缓冲液（PBS）： 常用0.1 M，pH 7.0（含1 mM EDTA，螯合金属离子）。
    • 还原型谷胱甘肽（GSH）： 反应体系中的还原底物。
    • 谷胱甘肽还原酶（GR）： 催化GSSG还原再生GSH。
    • β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）： GR的还原辅因子，也是监测指标。
    • 有机氢过氧化物底物： 常用叔丁基过氧化氢（t-BuOOH） 或枯烯过氧化氢（Cumene Hydroperoxide）。H₂O₂也可用，但易受样品中过氧化氢酶（Catalase）干扰，需注意抑制或扣除本底。浓度需优化。
    • 叠氮化钠（NaN₃）： （可选）用于抑制样品中可能存在的过氧化氢酶活性（当使用H₂O₂作底物时）。
  • 设备：
    • 紫外-可见分光光度计（配备恒温比色槽）
    • 恒温水浴锅或温控比色槽
    • 移液器及无菌枪头
    • 计时器
    • 比色皿（石英或UV塑料）
 

四、 实验步骤（示例流程）

以下是一个典型的反应体系配置步骤（体积和浓度需根据具体实验条件和试剂进行调整优化）：

  1. 配制预混液（Master Mix）： 在冰上或室温（根据试剂要求）配制足量用于所有反应的预混液。每毫升预混液通常包含：
    • 磷酸盐缓冲液（含EDTA, pH 7.0）
    • GSH（终浓度约1-2 mM）
    • GR（适量酶活单位，确保反应速率不受GR限制）
    • NADPH（终浓度约0.2-0.3 mM）
    • （可选）叠氮化钠（如使用H₂O₂）
  2. 预热： 将预混液、样品（用相同缓冲液适当稀释）、有机氢过氧化物底物溶液置于恒温水浴（通常37℃）中预热数分钟，使温度平衡。
  3. 设置空白反应：
    • 向比色皿中加入规定体积的预热预混液（如970 μL）。
    • 加入规定体积的缓冲液代替样品（如20 μL）。
    • 温和混匀。
    • 放入已恒温（37℃）的分光光度计比色槽中。
    • 设定分光光度计在340 nm波长，调零（或读取初始吸光度A₀）。
  4. 启动反应与读数：
    • 迅速加入预热好的有机氢过氧化物底物溶液（如10 μL，终浓度常用0.2-0.5 mM）。
    • 立即启动计时器并快速混匀（避免气泡）。
    • 连续监测340 nm处吸光度（A₃₄₀）的变化至少3-5分钟（通常每分钟记录一次读数，或仪器自动记录连续下降曲线）。
  5. 设置样品反应：
    • 重复步骤3，但用稀释好的待测样品溶液（如20 μL）代替缓冲液。
    • 加入底物启动反应后，同样连续监测A₃₄₀下降速率至少3-5分钟。
  6. 设置非酶反应对照： （重要！）
    • 设置一个反应管/比色皿：
      • 加入预混液和样品（同步骤5）
      • 加入缓冲液代替有机氢过氧化物底物
    • 该对照用于排除样品中可能存在的其他消耗NADPH的物质导致的非特异性氧化速率。最终计算GPx活性时，需从总下降速率中扣除此非酶速率。
 

五、 数据处理与计算

  1. 计算吸光度下降速率 (ΔA₃₄₀/min)：

    • 对每个反应（空白、样品、非酶对照）记录的A₃₄₀ - 时间曲线进行线性回归分析。
    • 求出反应线性阶段的斜率，单位为吸光度单位/分钟 (ΔA/min)。
    • 样品GPx反应速率 (Vs)： 样品管中加入底物后的斜率ΔA/min。
    • 非酶速率 (Vne)： 非酶对照（样品+无底物）的斜率ΔA/min。
    • 实际GPx催化的NADPH消耗速率 (ΔAgpx)：
      ΔAgpx = Vs - Vne
      （扣除样品本身非特异性消耗NADPH的影响）。

  2. 计算GPx活性：

    • 摩尔消光系数 (ε)： NADPH在340 nm处的摩尔消光系数为 6.22 × 10³ L·mol⁻¹·cm⁻¹ (在pH 7-8的缓冲液中)。
    • 比色皿光径 (d)： 通常为1 cm。如果使用其他光径（如0.5 cm），需相应调整。
    • 反应体系总体积 (Vt)： 单位毫升 (mL)。
    • 样品体积 (Vsample)： 单位毫升 (mL)。
    • 样品蛋白浓度 (Cprot)： 单位毫克/毫升 (mg/mL)。需提前用BCA法、Bradford法等测定。
    • GPx活性单位定义： 最常用的单位是U/mg prot，表示每分钟每毫克样品蛋白催化消耗1微摩尔（μmol）NADPH的酶量。
     

    计算公式：
    GPx活性 (U/mg prot) = (ΔAgpx / min) × (Vt × 10³) / (ε × d × Vsample × Cprot)

    参数解释与单位转换：

    • ΔAgpx / min: 实际GPx催化的吸光度下降速率 (ΔA/min)。
    • Vt × 10³: 将反应总体积Vt (mL) 转换为微升 (μL)。乘以10³是因为NADPH浓度变化在微摩尔尺度计算更方便。
    • ε: NADPH摩尔消光系数 (6.22 × 10³ L·mol⁻¹·cm⁻¹ = 6.22 × 10³ mL·μmol⁻¹·cm⁻¹)。使用mL·μmol⁻¹·cm⁻¹单位更匹配体积单位。
    • d: 比色皿光径 (cm)。
    • Vsample: 加入反应体系中的样品体积 (mL)。
    • Cprot: 加入样品的蛋白浓度 (mg/mL)。
    • 简化理解： 公式的核心部分是 (ΔAgpx / min) / (ε × d)，这计算出的是反应体系中NADPH的消耗速率（μmol/min）。然后除以加入的样品蛋白总量（Vsample × Cprot，单位为mg），即得到单位蛋白的酶活（μmol/min/mg prot = U/mg prot）。
     

    示例计算：

    • ΔAgpx/min = 0.050 /min
    • Vt = 1.00 mL
    • ε = 6220 mL·μmol⁻¹·cm⁻¹ (6.22 × 10³)
    • d = 1 cm
    • Vsample = 0.02 mL
    • Cprot = 5.0 mg/mL
    • GPx活性 = (0.050) × (1.00 × 1000) / (6220 × 1 × 0.02 × 5.0) = 50 / (6220 × 0.1) = 50 / 622 = 0.080 U/mg prot (每分钟每毫克蛋白消耗0.080 μmol NADPH)
 

六、 注意事项与影响因素

  1. 样品制备：
    • 组织/细胞需迅速处理，液氮速冻保存。
    • 匀浆/裂解缓冲液通常使用冰冷的PBS（含EDTA），防止酶失活。
    • 离心去除碎片后取上清，避免颗粒物干扰光路。
    • 准确测定上清液蛋白浓度。
  2. 试剂稳定性：
    • NADPH溶液需现配现用或分装避光-20℃保存，避免反复冻融（易氧化降解）。
    • GSH溶液也需新鲜配制或妥善保存（易被氧化）。
    • GR根据说明书要求保存和使用。
  3. 反应条件优化：
    • 温度： 严格恒温至关重要（通常37℃）。温度波动影响酶活性和反应速率。
    • pH： 常用pH 7.0缓冲液。偏离最适pH会显著影响GPx和GR活性。
    • 底物浓度： 需选择饱和浓度（达到最大反应速率Vmax）。可通过预实验确定t-BuOOH或CumOOH的最佳浓度（通常在0.2-0.5 mM范围）。
    • GSH浓度： 需足够高（1-2 mM）以维持反应进行，但过高可能轻微抑制GPx活性。
    • 反应线性： 监测时间需确保A₃₄₀下降在线性范围内（通常是反应开始后的前几分钟）。超出线性范围数据不可靠。
  4. 干扰因素：
    • 过氧化氢酶（Catalase）： 当样品中存在且使用H₂O₂作底物时，会竞争性催化H₂O₂分解，低估GPx活性。使用有机氢过氧化物（t-BuOOH, CumOOH）是首选方案。若必须用H₂O₂，需加入叠氮化钠（NaN₃）抑制过氧化氢酶（但NaN₃对某些GPx同工酶可能有微弱抑制作用）。
    • 其他NADPH氧化酶： 样品中可能存在除GR以外的消耗NADPH的酶或物质。设置严格的非酶反应对照（样品+无底物）并扣除其速率至关重要。
    • 混匀： 加入底物后立即充分混匀，避免局部浓度不均影响初始反应速率。
  5. 安全：
    • 有机过氧化物（如t-BuOOH, CumOOH）具有氧化性和潜在爆炸性（尤其浓溶液），需小心操作，储存于阴凉避光处。
    • 遵循实验室安全规范。
 

七、 应用与意义

NADPH消耗法因其原理清晰、操作相对简便、灵敏度较高、特异性较好（尤其使用有机底物时）而被广泛用于：

  • 评估不同生物样本（组织、细胞、血液）的GPx活性。
  • 研究氧化应激状态下（如疾病模型、药物/毒素处理、衰老）机体抗氧化酶系统的变化。
  • 筛选具有抗氧化活性的化合物或中药提取物对GPx活力的影响。
  • 比较不同物种、组织或生理病理状态下GPx活性的差异。
  • 作为评估机体整体抗氧化防御能力的重要指标之一。
 

八、 参考文献（经典方法学）

  1. Flohé, L., & Günzler, W. A. (1984). Assays of glutathione peroxidase. Methods in Enzymology, 105, 114–121. (详细讨论了不同GPx底物和测定方法，包括NADPH消耗法的理论基础)。
  2. Paglia, D. E., & Valentine, W. N. (1967). Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 70(1), 158–169. (早期建立并详细描述基于H₂O₂底物和NADPH消耗的GPx测定法，强调了非酶反应校正的重要性)。
  3. Wendel, A. (1981). Glutathione peroxidase. Methods in Enzymology, 77, 325–333. (提供了使用不同氢过氧化物底物测定GPx活性的具体方案，包括NADPH消耗法)。
  4. Lawrence, R. A., & Burk, R. F. (1976). Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient rat liver. Biochemical and Biophysical Research Communications, 71(4), 952–958. (描述了使用t-BuOOH作为底物的NADPH消耗法测定肝GPx活性)。
 

总结：

谷胱甘肽过氧化物酶NADPH消耗试验是一种基于酶偶联反应原理、通过监测NADPH在340 nm处吸光度下降速率来间接测定GPx活性的可靠方法。成功实施该方法的关键在于精确控制反应条件（温度、pH、底物浓度）、优化试剂浓度、准确扣除非酶背景干扰以及正确进行数据计算。尽管存在其他测定方法（如直接监测GSH消耗的DTNB法），NADPH消耗法因其良好的稳定性、通用性和相对简便性，依然是科研和临床检验中评估GPx活性的基石方法之一。

底部图片-PC版 底部图片-移动版