蛋白羰基ELISA定量

发布时间：2026-04-16 阅读量：92 作者：生物检测中心

蛋白羰基化检测：基于ELISA的定量分析方法

摘要： 蛋白质羰基化是蛋白质在活性氧（ROS）等氧化应激因子作用下发生的不可逆修饰，是氧化损伤的重要生物标志物。酶联免疫吸附测定（ELISA）因其高灵敏度、高通量和操作相对简便的特点，成为定量检测蛋白羰基化水平的重要工具。本文详细介绍了基于2,4-二硝基苯肼（DNPH）衍生化的蛋白羰基ELISA定量检测的原理、实验步骤、关键注意事项及数据分析方法。

一、 引言
氧化应激状态下产生的过量活性氧（如·OH， ONOO⁻， H₂O₂）可攻击蛋白质分子中的特定氨基酸残基（如赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸），导致其侧链发生氧化断裂，生成醛或酮类基团，即蛋白质羰基。蛋白羰基化水平升高与衰老、神经退行性疾病（如阿尔茨海默症、帕金森病）、心血管疾病、糖尿病、癌症以及多种炎症性疾病密切相关。因此，准确、灵敏地定量蛋白羰基化水平对于了解疾病的氧化应激状态、评估药物或抗氧化剂的功效具有重要价值。

二、 检测原理
基于DNPH衍生化的蛋白羰基ELISA定量检测的核心原理包含两个关键步骤：

  1. 化学衍生化 (Derivatization)：

    • 待测蛋白质样品与DNPH在酸性条件下孵育。
    • DNPH分子中的肼基（-NH-NH₂）特异性与蛋白质分子上的羰基（>C=O）发生加成反应，生成稳定的共价键结合的腙类衍生物（Protein-DNP）。
    • 此步骤将原本不易被抗体识别的蛋白羰基转化为带有2,4-二硝基苯基（DNP）标签的修饰蛋白（Protein-DNP）。

  2. 免疫学检测 (Immunoassay)：

    • 将衍生化后的蛋白质（Protein-DNP）包被于微孔板固相载体表面。
    • 加入特异性识别DNP标签的一抗（抗DNP抗体），该抗体会与固相表面的Protein-DNP结合。
    • 加入酶标记的二抗（如一抗种属来源特异性的辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP标记二抗），二抗与一抗结合。
    • 加入该酶对应的特异性底物（如TMB for HRP， pNPP for AP）进行显色反应。酶催化底物产生可检测信号（吸光度变化或荧光强度变化）。
    • 信号强度与包被在孔板上的Protein-DNP含量成正比，从而间接反映样品中原有的蛋白羰基化水平。
 

三、 实验材料与仪器

  • 主要试剂：
    • 2,4-二硝基苯肼（DNPH）溶液（通常溶于2M HCl中）。
    • 蛋白质裂解/提取缓冲液（如含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液）。
    • 蛋白质衍生化缓冲液（如含适量盐酸的缓冲液）。
    • 中和缓冲液（如含适量中和剂的缓冲液）。
    • 包被缓冲液（如碳酸盐缓冲液， PBS）。
    • 封闭缓冲液（如含脱脂奶粉或牛血清白蛋白的TBS或PBS）。
    • 洗涤缓冲液（如含Tween-20的TBS或PBST）。
    • 抗DNP一抗。
    • 酶标二抗（如HRP或AP标记）。
    • 相应显色底物（如TMB， ABTS for HRP； pNPP for AP）。
    • 终止液（如1M或2M H₂SO₄ for TMB； 3M NaOH for pNPP）。
    • 蛋白质定量试剂盒（如BCA法）。
    • 标准品（常用经已知浓度过氧化物如H₂O₂处理的完全羰基化标准蛋白，或用已知羰基含量的DNP化蛋白质）。
  • 主要仪器设备：
    • 酶标仪（适用于96孔微孔板，能读取特定波长吸光度或荧光）。
    • 恒温孵育器或水浴锅。
    • 微量移液器及配套吸头。
    • 振荡器（用于振荡孵育）。
    • 离心机。
    • 涡旋混合器。
    • 96孔微孔板。
    • 蛋白质定量所需设备（分光光度计或酶标仪）。
 

四、 实验步骤

  1. 样品制备 (Sample Preparation)：

    • 收集细胞、组织或体液（如血浆、血清）样本。
    • 使用含有蛋白酶抑制剂（防止蛋白降解）和（可选）金属螯合剂（如EDTA，防止体外氧化）的合适缓冲液裂解细胞或匀浆组织。
    • 离心（通常4°C， 10,000-15,000 g， 10-30分钟）去除不溶性物质，收集上清（蛋白裂解液）。
    • 使用BCA法或类似方法精确测定上清液的总蛋白浓度。将样品分装，-80°C保存（避免反复冻融）。注意：所有操作尽量在冰上进行以减少氧化。

  2. DNPH衍生化 (Derivatization with DNPH)：

    • 取适量蛋白样品（通常含10-50 μg总蛋白）置于微量离心管中。关键：设置样品管和空白对照管（后者不加DNPH进行衍生化）。
    • 加入适量DNPH溶液（体积比通常为1：4 - 1：1，依据试剂说明调整），充分混匀（如涡旋）。
    • 避光条件下，室温（约20-25°C）振荡孵育15-45分钟（依据试剂说明优化孵育时间）。注意：避光和精确孵育时间对重现性至关重要。
    • 加入适量中和缓冲液终止反应（可选步骤，或后续通过洗涤去除多余试剂）。注意：中和液的成分和体积需保证后续包被或稀释操作不影响pH和蛋白稳定性。

  3. 包被 (Coating)：

    • 衍生化后样品可用包被缓冲液适当稀释（依据预实验结果）。
    • 将稀释好的衍生化样品（Protein-DNP）加入96孔微孔板的孔中（如100 μL/孔）。
    • 设置标准品孔（用已知羰基含量的标准品按梯度稀释后同样包被）和空白孔（仅加包被缓冲液）。
    • 4°C孵育过夜（12-16小时）或室温（约25-37°C）孵育1-3小时，使蛋白吸附于孔壁。注意：包被浓度和时间需优化以保证信号在线性范围内。

  4. 洗涤 (Washing)：

    • 倾去孔内液体。
    • 用洗涤缓冲液（如PBST）洗涤板孔（每孔加200-300 μL）。
    • 室温静置浸泡1-3分钟后倾去液体。重复洗涤3-5次。
    • 最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干孔板以移除残留液体。注意：洗涤步骤对降低背景信号非常关键。

  5. 封闭 (Blocking)：

    • 每孔加入200-300 μL封闭缓冲液。
    • 室温孵育1-2小时（或4°C过夜）。
    • 倾去封闭液，洗涤板孔3-5次（同步骤4）。

  6. 一抗孵育 (Primary Antibody Incubation)：

    • 用封闭缓冲液或抗体稀释液按说明书推荐比例稀释抗DNP一抗。
    • 每孔加入适量稀释后的一抗（如100 μL/孔）。
    • 室温孵育1-2小时（或4°C过夜）。
    • 倾去一抗，洗涤板孔3-5次（同步骤4）。

  7. 二抗孵育 (Secondary Antibody Incubation)：

    • 用封闭缓冲液或抗体稀释液按说明书推荐比例稀释酶标二抗。
    • 每孔加入适量稀释后的二抗（如100 μL/孔）。
    • 室温孵育1小时（避光条件下孵育）。注意：孵育时间和温度需优化。
    • 倾去二抗，彻底洗涤板孔5-7次（同步骤4），尽可能移除未结合的二抗。

  8. 显色 (Substrate Development)：

    • 根据所用酶标二抗的类型（HRP或AP），准备对应的显色底物溶液（如TMB）。
    • 按说明书要求，每孔加入新鲜配制的底物溶液（如100 μL/孔）。注意：显色底物通常对光敏感，需避光操作。
    • 室温避光孵育。关键：密切监控显色反应进程（通常5-30分钟），当标准品孔显现明显梯度颜色或阳性对照孔达到预定吸光度时立即终止。

  9. 终止与读数 (Stop Reaction and Detection)：

    • 加入终止液终止显色反应（如HRP/TMB体系加入等体积的1M或2M H₂SO₄； AP/pNPP体系加入等体积的3M NaOH）。
    • 轻轻晃动板孔使反应混合均匀。
    • 立即在酶标仪上读取特定波长下的吸光度（OD值）。例如：TMB终止后通常在450nm读取主波长，620-650nm可作为参考波长扣除板本身的光散射；pNPP终止后在405-415nm读取。注意：读取波长务必与底物系统匹配。
 

五、 数据分析与计算

  1. 原始数据处理：

    • 计算每个孔的净吸光度（Net OD）： Net OD = OD Sample (或Std) - OD Blank (包被缓冲液孔) 注：有时空白对照孔OD值很低，也可近似用Net OD = OD Sample (或Std)。
    • 计算空白衍生化对照孔的Net OD值（代表非特异性信号），在后续计算中通常需要从样品或标准品OD值中扣除（如果信号较高）。
    • 记录标准品各浓度点的Net OD值。

  2. 标准曲线绘制与样品羰基含量计算：

    • 以标准品的羰基含量（单位通常为nmol/mg Protein）为横坐标（X轴），对应的Net OD值为纵坐标（Y轴）。
    • 使用合适的回归分析方法（常用四参数逻辑回归或线性回归，取决于标准曲线的形状）拟合标准曲线，得到回归方程 Y = f(X)。关键：标准曲线应在OD值范围内具有良好的线性或可拟合性（R² > 0.98）。
    • 将每个待测样品孔的Net OD值代入标准曲线的回归方程，计算出该样品孔的“羰基当量值”（X_sample，单位与标准品一致，通常为nmol/mg）。

  3. 结果表达：

    • 由于衍生化前已测定样品总蛋白浓度，样品最终的蛋白羰基化水平表示为：蛋白质羰基含量 (nmol/mg Protein) = X_sample
    • 报告中应包含每个样品的重复测定值（通常建议≥3个技术重复）及其平均值±标准差（Mean ± SD）。
    • 不同处理组间的比较使用适当的统计方法（如t检验， ANOVA）。
 

六、 关键注意事项与优化

  • 样品处理： 迅速处理样本并冻存于-80°C。提取过程保持低温，添加蛋白酶抑制剂和金属螯合剂，尽量减少体外氧化。溶血样品可能导致假阳性，需注意。
  • 衍生化反应： 避光和精确控制孵育时间是关键。DNPH浓度、反应温度均需优化。过长的孵育时间或过高温度可能导致非特异性反应或蛋白降解。
  • 包被效率： 样品蛋白浓度过高可能导致包被过饱和，过低则信号弱。需通过预实验确定最佳包被浓度（通常1-10 μg/mL）。
  • 非特异性结合： 充分的洗涤和有效的封闭是降低背景信号的核心。封闭剂（BSA，奶粉）的选择和浓度需优化。一抗、二抗的浓度（效价）也显著影响信噪比，应通过预实验滴定最佳稀释度。
  • 标准品： 使用高质量的、经准确标定的标准品至关重要。确保标准品与待测样品经历相同的衍生化过程（或使用已知羰基含量的DNP化标准蛋白）。
  • 对照设置：
    • 空白衍生化对照： 样品不加DNPH但经历后续所有步骤，用于评估非衍生化蛋白与抗体的非特异性结合。
    • 阴性对照： 仅加包被缓冲液，用于扣除板背景。
    • 阳性对照： 已知羰基化程度较高的样品（如过氧化处理的蛋白），用于监控实验效率和重现性。
    • 标准品： 准确建立定量关系。
  • 重复性： 建议设置足够的生物学重复和技术重复以确保结果可靠。
  • 仪器： 确保酶标仪性能稳定，定期校准。读取吸光度前确认孔内无气泡。
 

七、 总结

基于DNPH衍生化的ELISA方法是定量检测蛋白羰基化水平的可靠、灵敏且高通量的技术。其成功实施依赖于对原理的透彻理解、实验流程的严格优化（尤其是衍生化、洗涤和抗体浓度）以及严谨的对照设置和数据分析。通过精确测定这一重要的氧化应激生物标志物，该方法在基础医学研究、疾病机制探索、药物开发和营养干预效果评估等领域具有广泛的应用价值。

参考文献： (此处列举部分代表性方法学文献，实际写作需根据具体引用)

  1. Levine, R. L., Williams, J. A., Stadtman, E. R., & Shacter, E. (1994). Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods in enzymology, 233, 346–357.
  2. Buss, H., Chan, T. P., Sluis, K. B., Domigan, N. M., & Winterbourn, C. C. (1997). Protein carbonyl measurement by a sensitive ELISA method. Free radical biology & medicine, 23(3), 361–366.
  3. Shacter, E. (2000). Quantification and significance of protein oxidation in biological samples. Drug metabolism reviews, 32(3-4), 307–326.
  4. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Giustarini, D., Milzani, A., & Colombo, R. (2003). Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clinica Chimica Acta, 329(1-2), 23–38.
  5. Yan, L. J., & Forster, M. J. (2011). Chemical probes for analysis of carbonylated proteins: a review. Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences, 879(17-18), 1308–1315.
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