线栓法局灶性脑缺血模型(大/小鼠)

线栓法局灶性脑缺血模型(大/小鼠)检测项目详解

线栓法（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）是建立大/小鼠局灶性脑缺血（常模拟缺血性中风）及缺血再灌注损伤的金标准模型。其核心在于通过插入线栓暂时或永久阻塞大脑中动脉起始段，导致其供血区域（主要是皮层和纹状体）缺血。模型成功建立后，系统、多层次的检测是评估缺血损伤程度、探索病理机制及评价干预措施效果的关键。以下将重点详述该模型常用的检测项目：

一、 模型成功性验证与核心形态学评估

1. 激光多普勒血流仪监测：

   • 目的： 实时、客观 验证线栓插入是否成功阻塞MCA导致局部脑血流量显著下降（通常下降至基线的20%以下），以及再灌注时血流是否有效恢复（用于缺血再灌注模型）。
   • 方法： 在开颅骨窗（常在颅骨上钻一小孔）或通过薄化的颅骨，将探头固定于MCA供血区域（常为颞顶叶皮层）表面。
   • 关键点： 是手术操作成功与否的即时金标准。

2. 神经功能缺损评分：

   • 目的： 快速、简便 评估动物在清醒状态下的神经功能损伤程度，反映模型的整体效果。常在术后24小时（或更早）进行。
   • 常用评分系统：
     • Longa评分（5分制）： 最常用。
       • 0分：无神经缺损症状。
       • 1分：提尾时对侧前肢不能完全伸展（轻度损伤）。
       • 2分：向对侧转圈（中度损伤）。
       • 3分：向对侧倾倒（中重度损伤）。
       • 4分：不能自发行走，意识丧失（重度损伤）。
     • Bederson评分（4分制）： 侧重姿势反射（提尾悬空、平台倾斜等）。
     • Garcia评分（18分制）： 更全面，评估运动、感觉、反射、平衡等6个项目（各0-3分），敏感性更高，但耗时较长。
   • 关键点： 操作者需经培训，最好采用盲法评估（评估者不知分组）。

3. 脑梗死体积测定：

   • 目的： 定量评估 缺血导致的脑组织坏死范围，是评价模型损伤严重程度和干预措施保护效果的最核心形态学指标。
   • 常用方法：
     • 氯化三苯基四氮唑染色：
       • 原理： 活细胞线粒体中的脱氢酶可将无色的TTC还原为红色的甲臜，而梗死区（无活性酶）则保持苍白。
       • 步骤： 动物处死后快速取脑，切成2mm厚冠状切片，37°C避光孵育于2% TTC溶液15-30分钟，随后用4%多聚甲醛固定。拍照后，利用图像分析软件（如ImageJ）分别测量每片脑切片上梗死区（白色）和正常区（红色）的面积，结合切片厚度计算每片梗死体积，最后累加得到全脑梗死体积。
       • 优点： 快速、直观、成本低、定量准确。
       • 缺点： 需新鲜脑组织，无法用于长期研究（如数周后梗死灶已被吸收）；不能区分缺血核心区和半暗带。
     • 苏木精-伊红染色：
       • 原理： 常规组织学染色。坏死区神经元表现为核固缩、核碎裂、胞体肿胀或皱缩、嗜酸性变（红染），结构疏松水肿，炎细胞浸润。
       • 步骤： 脑组织经固定（4%多聚甲醛）、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、封片后在显微镜下观察。
       • 优点： 可观察细胞形态变化，适用于任何时间点。
       • 缺点： 定量梗死体积不如TTC精确便捷，常需结合图像分析进行半定量或特定层面的测量。
     • 尼氏染色：
       • 原理： 染色神经元尼氏体（粗面内质网和核糖体）。缺血损伤神经元尼氏体溶解消失。
       • 目的： 更特异性地显示神经元损伤。
     • 磁共振成像：
       • 原理： 利用DWI（弥散加权成像）可在缺血后极早期（数十分钟）检测细胞毒性水肿（表观弥散系数ADC值下降），T2WI在后期（数小时至数天）显示血管源性水肿（高信号）。结合软件可精确计算梗死体积。
       • 优点： 无创、可活体动态监测同一动物不同时间点的梗死灶演变（时间纵向研究）。
       • 缺点： 设备昂贵，操作和分析复杂，动物需麻醉。
   • 关键点：
     • 结果常以梗死体积占对侧半球体积的百分比或全脑体积的百分比表示，以校正个体脑体积差异。
     • 常用公式：梗死体积 (%) = (对侧半球体积 - 同侧未梗死体积) / 对侧半球体积 × 100% 或 梗死体积 (%) = 梗死区域体积 / (同侧半球体积 + 对侧半球体积) × 2 × 100%。选择取决于研究设计和软件功能。
     • 区分梗死体积（不可逆损伤）和水肿校正后的梗死体积（有时水肿会使未梗死区域被误算为梗死区）。

二、 组织病理学与细胞学评估

1. 脑水肿评估：

   • 目的： 缺血后常伴随血管源性脑水肿，导致颅内压升高，是继发性损伤的重要原因。
   • 方法：
     • 干湿重法： 快速分离缺血侧半球和对侧半球，立即称湿重，然后放入烘箱（通常100-110°C）干燥24-48小时至恒重后称干重。脑含水量 (%) = [(湿重 - 干重) / 湿重] × 100%。水肿程度 = 缺血侧含水量 - 对侧含水量。
     • 组织学观察： HE染色切片中可见细胞间隙增宽、空泡形成等水肿表现。

2. 神经元损伤与死亡评估：

   • HE染色、尼氏染色： 如前所述，观察神经元形态学变化（固缩、坏死、尼氏体溶解）。
   • 免疫组织化学/免疫荧光染色：
     • 神经元标志物： NeuN, MAP2, β-III tubulin。染色阳性细胞数量减少或形态异常反映神经元丢失或损伤。
     • 凋亡/坏死标志物：
       • TUNEL染色： 检测DNA断裂片段（凋亡晚期和坏死均可阳性），标记死亡细胞。
       • 活化的Caspase-3： 细胞凋亡的关键执行者，其活化形式出现提示凋亡途径激活。
       • Fluoro-Jade B/C： 特异性标记变性神经元（包括凋亡和坏死早期）。
     • 自噬标志物： LC3-II (免疫荧光观察点状聚集)，p62/SQSTM1 (自噬流受阻时积累)。
   • 电子显微镜： 观察亚细胞结构变化（如线粒体肿胀、嵴断裂，内质网扩张，染色质凝聚等），精确判断死亡模式（凋亡、坏死、自噬性死亡）。

3. 神经胶质细胞活化与神经炎症评估：

   • 免疫组织化学/免疫荧光染色：
     • 小胶质细胞/巨噬细胞： Iba1 (泛小胶质/巨噬细胞标记)，CD68 (标记活化吞噬状态)，CD16/32 (M1促炎表型)，CD206/Arg1 (M2抗炎修复表型)。观察其形态变化（活化时胞体变大、突起变短粗）、数量增多及分布。
     • 星形胶质细胞： GFAP (星形胶质细胞标记，活化时表达增强、细胞肥大增生)，观察其反应性增生（胶质瘢痕形成）。
   • 炎症因子检测： 在脑组织匀浆或血清中，通过ELISA、Luminex或qRT-PCR检测促炎因子(TNF-α, IL-1β, IL-6)和抗炎因子(IL-4, IL-10, TGF-β)的水平。

4. 血脑屏障破坏评估：

   • 目的： 缺血损伤可破坏BBB完整性，导致血管源性水肿和有害物质进入脑实质。
   • 方法：
     • Evans Blue 渗出试验：
       • 原理： EB染料在体内与血浆白蛋白结合，正常情况下无法透过完整BBB。BBB破坏后，EB-白蛋白复合物渗入脑组织。
       • 步骤： 静脉注射EB (2%, 4-5ml/kg)，1-2小时后灌注生理盐水至流出液无色，取缺血侧和对侧脑组织称重，用甲酰胺（或其他溶剂）55°C孵育48小时提取EB，用分光光度计测定620nm吸光度。根据标准曲线计算EB含量(μg/g脑组织)。
     • 免疫组织化学： 检测紧密连接蛋白（如Claudin-5, Occludin, ZO-1）的表达和分布连续性是否被破坏。
     • MRI： 动态对比增强MRI (DCE-MRI)可无创评估BBB通透性。

5. 血管生成评估：

   • 目的： 在恢复期（数天至数周后），缺血周边区可能发生血管新生。
   • 方法：
     • 免疫组织化学/免疫荧光染色： 内皮细胞标志物CD31 (PECAM-1), CD34, vWF。通过计数微血管密度（常以CD31阳性管腔结构数量/视野表示）评估。
     • 微血管灌注评估： 动物死前注射血管内皮特异性染料（如FITC-dextran, lectin），灌注固定后取脑切片，直接观察被染料标记的、有功能的血管。

三、 分子生物学检测

1. 基因表达水平：

   • 实时荧光定量PCR： 检测缺血脑组织中特定基因（如炎症因子、凋亡相关基因、神经营养因子、抗氧化酶、自噬相关基因等）的mRNA表达变化。
   • RNA测序： 全面分析缺血后全基因组转录水平的变化，发现新的调控靶点和通路。

2. 蛋白质表达与活化水平：

   • Western Blot： 检测目标蛋白在缺血脑组织中的总表达量、磷酸化水平（反映活化状态，如p-Akt, p-ERK, p-JNK）、剪切状态（如Cleaved Caspase-3）等。
   • ELISA/Luminex： 定量检测脑组织匀浆上清或血清中特定蛋白质（如细胞因子、神经营养因子、损伤相关分子模式DAMPs）的浓度。
   • 免疫组织化学/免疫荧光： 如前所述，提供蛋白表达的空间定位信息。

四、 行为学功能恢复评估 (中长期研究重点)

1. 运动功能评估：

   • 转棒疲劳实验： 测试动物的平衡协调能力和耐力。记录动物在加速或匀速旋转的棒上停留的时间或跌落时的转速。
   • 网格行走实验： 观察动物在网格上行走时，对侧前肢踩空或滑落的次数，评估精细运动协调性。
   • 前肢抓力测试： 测量动物前肢的最大抓力，反映肌肉力量和运动功能。
   • 肢体不对称性测试： 如圆柱体测试，观察动物在直立探索时使用对侧前肢的偏好性降低。

2. 感觉功能评估：

   • 触觉刺激反应： 用Von Frey细丝刺激对侧前肢或胡须区域，测定诱发缩爪或甩头反射的阈值，评估感觉敏感性变化（常出现痛觉过敏）。
   • 粘胶去除测试： 将对侧前肢或身体贴上小粘纸，记录动物感知并去除粘纸所需时间，评估感觉忽视和运动执行能力。

3. 认知功能评估：

   • Morris水迷宫： 经典的空间学习和记忆测试。记录动物寻找隐藏平台的潜伏期、路径长度，以及空间探索期在目标象限停留的时间百分比。
   • 新物体识别测试： 测试非空间工作记忆和识别记忆。记录动物探索新物体和熟悉物体的时间，计算识别指数。
   • 恐惧条件反射： 测试联想学习记忆能力（特别是海马依赖的情境恐惧记忆）。

五、 其他检测

• 脑组织代谢物检测： 磁共振波谱可无创检测缺血脑内代谢物变化（如Lac升高，NAA降低，Cho/Cr变化）。
• 氧化应激指标： 检测脑组织匀浆中丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等水平，评估氧化损伤程度和抗氧化能力。
• 血流动力学监测： 在长期研究中，可监测血压、心率等基础生理指标。

总结与选择建议：

• 模型验证核心： 激光多普勒血流监测 + 术后24小时神经功能评分 + TTC染色测梗死体积 是验证模型成功与否和评估基础损伤程度的黄金组合。
• 机制研究： 根据研究目的，选择相应的组织学（IHC/IF观察特定细胞和蛋白）、分子生物学（WB, qPCR, ELISA）检测，深入探索炎症、凋亡、自噬、氧化应激、BBB破坏、血管新生等具体病理过程。
• 药效/治疗评价：
  • 急性期保护： 重点评估梗死体积缩小、水肿减轻、神经评分改善、特定病理指标（如凋亡细胞减少、炎症因子降低）改善。
  • 中长期恢复： 除形态学外，行为学功能恢复（运动、感觉、认知）是评价最终功能预后的关键指标。
• 时间点选择： 检测时间点至关重要。急性期（数小时-3天）侧重损伤评估；亚急性期（3-14天）侧重修复启动（如胶质反应、血管新生）；慢性期（>2周）侧重组织重塑和功能恢复。应根据科学问题和干预措施性质精心设计时间点。
• 多维度结合： 单一指标往往不足以全面反映复杂的脑缺血损伤与修复过程。结合形态学、分子生物学、功能学等多层次、多时间点的评估，才能获得更全面、可靠的研究结论。

选择合适的检测项目并严格规范操作流程，是确保线栓法MCAO模型研究结果科学、可靠、可重复的关键所在。务必根据具体的研究目的、资源和时间进行合理规划和优化。