质谱法HCP定性、定量

发布时间：2025-06-12 16:05:24 阅读量：13 作者：生物检测中心

质谱法在宿主细胞蛋白定性与定量分析中的应用

一、 引言

在生物制药（如单克隆抗体、重组蛋白、疫苗等）的生产过程中，宿主细胞蛋白（Host Cell Proteins, HCPs）是一类关键的过程相关杂质。它们是生产过程中使用的宿主细胞（如CHO细胞、大肠杆菌、酵母等）自身表达的产物，而非目标药物分子。尽管经过复杂的下游纯化工艺，痕量的HCPs仍可能残留在最终产品中。

残留的HCPs可能带来多种风险：

  1. 潜在的免疫原性： 可能引发患者的不良免疫反应。
  2. 影响产品稳定性： 某些HCPs可能具有酶活性（如蛋白酶），降解治疗性蛋白，缩短产品有效期或改变其生物学活性。
  3. 影响产品安全性： 存在未知的生物活性风险。
  4. 反映生产工艺的一致性与稳定性： HCPs的残留种类和水平是衡量生产工艺稳健性和纯化效率的关键指标。

因此，对生物制品中HCPs进行准确、灵敏的定性和定量分析，是生产工艺开发、优化、验证以及药品放行质量控制中不可或缺的环节。质谱法凭借其独特的技术优势，已成为HCP研究不可或缺的工具。

二、 传统检测方法（免疫分析法）的局限性

长期以来，酶联免疫吸附测定法（ELISA）是HCP定量的主流方法。然而，ELISA存在显著的局限性：

  1. 抗体依赖性与覆盖度限制： ELISA依赖于能够识别多种HCP的抗血清。由于抗血清可能无法识别所有HCP（尤其是低丰度、弱免疫原性或翻译后修饰变化的HCP），导致定量结果偏低（假阴性），无法真实反映总HCP水平。
  2. 定性能力有限： ELISA通常只能提供总量信息（以某种参照标准的当量表示），无法提供残留HCP的具体种类、数量及其丰度信息。
  3. 通量相对较低： 对于需要大量样本分析的工艺开发阶段，通量受限。
  4. 方法开发复杂耗时： 高质量、广谱覆盖的抗血清开发和ELISA方法的建立与验证过程复杂且耗时。

三、 质谱法的优势

基于液相色谱与串联质谱联用（LC-MS/MS）的技术，为HCP分析提供了革命性的解决方案：

  1. 高特异性与准确性： 基于肽段和蛋白的精确质量（MS）及其碎片特征（MS/MS），实现对HCP的精准鉴定（定性）。
  2. 无偏向性与高覆盖度： 理论上可以检测样品中所有可被酶解并离子化的肽段，不受预先制备抗体的限制，能发现未知或低丰度HCP，提供更全面的HCP谱图。
  3. 强大的定性能力： 不仅能给出HCP总量，更能明确鉴定出残留的具体是哪些HCP，并获得其相对或绝对丰度信息。
  4. 高灵敏度： 现代高分辨质谱仪可检测到ppm (μg/g) 甚至ppb (ng/g) 级别的HCP。
  5. 可进行绝对定量： 通过与同位素标记标准肽段结合，可实现特定目标HCP的绝对定量。
  6. 高选择性： 即使在高浓度药物蛋白存在下，也能有效检测低丰度HCP。
  7. 信息丰富： 可同时获得HCP的鉴定、定量和潜在的翻译后修饰信息。

四、 质谱法用于HCP定性分析

目标是鉴定样品中存在的HCP种类：

  1. 样品制备：
    • 药物蛋白去除（富集）： 由于药物蛋白浓度远高于HCPs (通常高4-6个数量级)，通常需要利用其特性（如Protein A/G亲和层析抗体Fc段）将其大部分去除，富集HCPs，降低动态范围，显著提高低丰度HCP检出率。
    • 酶解： 将富集后的HCP混合物（包含残留药物蛋白）用蛋白酶（最常用胰蛋白酶）消化成肽段混合物。
  2. 液相色谱分离（LC）： 酶解后的肽段混合物通过反相液相色谱（RPLC）进行分离，基于疏水性差异将肽段在时间维度上分开，减少质谱进样时的离子抑制效应。
  3. 质谱分析（MS/MS）：
    • 一级质谱（MS1）： 测量进入质谱的肽段离子的质荷比（m/z）。
    • 二级质谱（MS2）： 从MS1中选择特定肽段离子（母离子），进行碎裂（通常通过碰撞诱导解离CID或高能碰撞解离HCD），产生碎片离子（子离子）。碎片离子谱图包含了该肽段的氨基酸序列信息。
  4. 数据库搜索与鉴定：
    • 将获得的MS/MS谱图与宿主细胞基因组/转录组/蛋白质组数据库进行比对搜索。
    • 搜索软件（如Mascot, Sequest, MaxQuant, Andromeda等）利用算法解析碎片离子谱图，推导出肽段序列，并与数据库中的理论蛋白序列进行匹配，给出可能的肽段和蛋白鉴定结果。
    • 鉴定结果通常使用严格的统计学标准进行过滤（如FDR ≤ 1%），以提高结果可靠性。
  5. 数据分析与报告： 输出鉴定到的HCP列表（蛋白ID、名称、描述等）及其相关的鉴定置信度信息。

五、 质谱法用于HCP定量分析

目标是对鉴定到的HCP进行相对或绝对丰度比较：

  1. 样品制备： 同样需要药物蛋白富集和酶解步骤。
  2. 定量策略：
    • 非标记定量（Label-Free Quantification, LFQ）：
      • 原理： 基于肽段离子在LC-MS/MS运行中的信号强度（谱图计数、峰面积、峰高）或MS1层面前体离子强度（Precursor Ion Intensity）进行相对定量比较（如不同工艺批次、不同纯化阶段的样品间比较）。
      • 流程： 所有样品单独处理、单独运行LC-MS/MS。通过软件进行肽段匹配（Peak Matching/Alignment）和强度提取，将同一肽段在不同样品中的强度进行比较，计算蛋白丰度变化。
      • 优点： 简单、成本低、无样品处理限制。
      • 缺点： 重复性相对较低，要求极高的色谱重现性；对实验条件变化敏感；动态范围有限。
    • 标记定量（Isobaric Labeling）：
      • 原理： 在酶解后，对不同来源样品（如不同处理组、不同时间点）的肽段分别标记化学结构相同但同位素组成不同的标签（如TMT, iTRAQ）。标记后的肽段混合，进行LC-MS/MS分析。在MS1中标记肽段无法区分，但在MS2中，标签报告离子释放，其强度比例直接反映不同样品中该肽段的原始丰度比例。
      • 优点： 可同时分析多个样品（TMTpro最多18个），提高通量和实验效率；混合后上样，减少仪器波动影响，提高定量精度；内标性强。
      • 缺点： 标记试剂成本高；标记反应可能不完全或有偏好性；单个MS2谱图可能来源于多个共洗脱肽段（“压缩效应”），影响定量准确性（需通过额外分离或校正算法缓解）。
    • 靶向定量（如平行反应监测/PRM 或 选择反应监测/SRM）：
      • 原理： 基于前期定性或文献已知的关键HCP（如高风险HCP、工艺指示HCP），设计特异性的目标肽段（Proteotypic Peptides）及其对应的特征碎片离子（Transitions）。质谱仅针对预设的目标肽段进行反复、高灵敏度和高选择性的监测（MS2）。通常与合成同位素标记肽段（SIS）作为内标结合，实现高精度的绝对定量（AQUA, SISPrM）。
      • 流程： 样品酶解后，加入已知浓度的稳定同位素标记的标准肽段（SIS）。色谱分离目标肽段及对应的SIS。质谱监控目标肽段和SIS的特征碎片离子。通过比较目标肽段信号与其SIS信号的比例来计算样品中目标肽段的绝对量，进而计算目标HCP的浓度。
      • 优点： 灵敏度、选择性和特异性极高；定量准确度和精密度最好（类似金标准）；通量相对较高（一次运行可监测数十个目标蛋白）。
      • 缺点： 前期需要开发验证；只能定量预设的目标HCP，无法发现新HCP；依赖于合成SIS肽段的可用性和成本。
  3. 数据处理与定量： 使用专业软件（如Skyline, MaxQuant, Proteome Discoverer, Spectronaut等）提取离子色谱图峰面积，计算肽段/蛋白的相对比例或绝对浓度。

六、 方法开发与验证要点

质谱法用于HCP分析需要进行严谨的方法开发与验证：

  1. 药物蛋白高效去除/富集方案优化： 目标是最大化HCP回收率同时最小化药物蛋白残留。
  2. 酶解效率优化： 确保酶解充分、重现性好。
  3. LC梯度优化： 实现复杂肽段混合物的最佳分离。
  4. 质谱参数优化： 包括电离条件、扫描范围、分辨率、碎裂能量等。
  5. 数据库选择与构建： 使用高质量、完整的宿主细胞特异性数据库至关重要。可能需要整合基因组、转录组和已知蛋白组数据。
  6. 验证参数（针对定量方法）：
    • 特异性： 证明方法能区分目标分析物（HCP肽段）与基质干扰（如药物蛋白肽段）。
    • 准确度： 通常通过加标回收率（Spike Recovery）实验评估（如将已知量的重组HCP或SIS肽段加入样品）。
    • 精密度： 包括重复性（Intra-day）和中间精密度（Inter-day），评估多次测量的变异系数（CV%）。
    • 灵敏度： 确定检测限（LOD）和定量限（LOQ）。
    • 线性与范围： 评估定量范围内信号响应与浓度的线性关系。
    • 耐用性： 评估方法对微小实验条件变化的抵抗能力（如柱温、流速微小变化）。
    • 残留效应（Carryover）： 评估高浓度样品是否对后续低浓度样品分析造成污染。

七、 应用场景

  1. 工艺开发与优化： 评估不同宿主细胞株、发酵条件、收获时间、纯化步骤（亲和、离子交换、疏水、分子筛等）对HCP清除效率的影响，指导工艺优化。
  2. 工艺表征与验证： 建立HCP清除的工艺能力，识别关键工艺参数（CPPs），确证工艺稳健性。
  3. 可比性研究： 评估工艺变更（如规模放大、场地转移、原材料变更）前后HCP谱图和水平是否可比。
  4. 稳定性研究： 监测药物在储存过程中HCP谱图或特定关键HCP水平的变化，评估其对产品稳定性的潜在影响。
  5. 杂质安全性评估： 鉴定和定量可能具有高风险（如酶活性、免疫原性）的特定HCP（如磷脂酶B样蛋白PLBL2、溶酶体蛋白酶Cathepsins等）。
  6. 放行检测支持与补充： 作为ELISA检测的重要补充，尤其是在ELISA可能低估总HCP或需要关注特定HCP时。某些情况下，质谱定量方法（尤其靶向PRM）也可用于关键HCP的放行检测。

八、 挑战与展望

尽管质谱法优势显著，仍面临一些挑战：

  1. 动态范围： 药物蛋白与残留HCP的浓度差异巨大（10^4 - 10^6倍），即使经过富集，低丰度HCP的检测仍具挑战。多维分离（如HCP样品分级）、深度分级、最新一代超高灵敏度质谱仪有助于改善。
  2. 样品制备复杂性： 富集步骤可能引入偏差（某些HCP丢失），且过程繁琐，通量受限。自动化样品处理平台是发展方向。
  3. 数据分析复杂性： 海量质谱数据的处理、分析和解读需要专业的知识和工具。人工智能（AI）和机器学习（ML）在数据处理、肽段识别和关键HCP风险预测方面具有巨大潜力。
  4. 靶向定量方法开发成本与时间： 开发验证一个可靠的靶向质谱方法仍需要相当的资源和时间。
  5. 法规接受度： 相较于成熟的ELISA，质谱法用于放行检测仍需积累更多验证数据和行业/监管共识。监管机构（如FDA, EMA）对质谱的应用日益关注和开放。

九、 结论

质谱法凭借其高特异性、高灵敏度、无偏向性和强大的定性定量能力，已成为生物制药领域HCP杂质研究的核心技术和强大工具。它克服了传统免疫分析法的固有局限，能够提供关于HCP残留种类、数量和丰度的全面而深入的信息。在工艺开发优化、杂质清除评估、可比性研究、安全性评估和质量控制中发挥着不可替代的作用。虽然面临动态范围、样品通量、数据分析等挑战，随着技术的不断进步（如更高性能的质谱仪、更智能的软件、自动化平台）和法规环境的逐步完善，质谱法在HCP分析中的应用将更加广泛、深入和常规化，为生产更安全、更有效的生物制品提供坚实的保障。持续优化样品前处理流程、开发更稳健的自动化富集方法、建立通用的数据分析标准和数据库、推动监管对话，是未来发展的关键方向。