金针虫病害生物防治：生防菌株抑制效果评估报告
摘要：
本研究评估了两种生防菌株（球孢白僵菌Beauveria bassiana 菌株BB-ARSEF 2860及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae 菌株MA-ARSEF 3297）对金针虫（Agriotes spp.）幼虫的室内致病力。采用浸渍法处理，实验设定不同浓度梯度（1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷ 孢子/mL），记录处理后3、5、7、10、14天的累计死亡率。结果显示，两种菌株均表现出显著的杀虫活性，其效果随孢子浓度升高和处理时间延长而增强。BB-ARSEF 2860在最高浓度（1×10⁷ 孢子/mL）处理14天后校正死亡率达92.5%，LC₅₀值为6.3×10⁵ 孢子/mL；MA-ARSEF 3297在相同条件下校正死亡率为85.7%，LC₅₀值为1.1×10⁶ 孢子/mL。研究表明所选生防菌株对金针虫具有良好抑制潜力。
1. 引言
金针虫是鞘翅目叩甲科幼虫的统称，作为重要的地下害虫，其幼虫长期隐匿于土壤中蛀食作物幼苗根茎、块茎及种子，严重威胁玉米、马铃薯、花生等多种农作物的产量与品质。长期依赖化学农药不仅易诱发害虫抗药性，亦对土壤生态环境及非靶标生物构成威胁。利用昆虫病原真菌进行生物防治因其环境友好性及可持续性，成为重要的替代策略。本研究旨在通过规范的室内毒力测定，评估特定昆虫病原真菌菌株对金针虫幼虫的侵染致病能力及致死效果，为金针虫绿色防控提供科学依据及潜在的微生物资源。
2. 材料与方法
2.1 供试生物材料
- 病原菌：
- 球孢白僵菌 (Beauveria bassiana) 菌株 BB-ARSEF 2860（来源：公开菌种保藏中心）
- 金龟子绿僵菌 (Metarhizium anisopliae) 菌株 MA-ARSEF 3297（来源：公开菌种保藏中心）
- 供试昆虫： 金针虫 (Agriotes obscurus) 三龄幼虫，采集自未施用杀虫剂的农田，室内用湿润消毒土壤及健康甘薯块暂养7天，选取健康活泼、大小一致的个体用于试验。
2.2 菌剂制备
- 将冻干菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板，25±1℃恒温培养7-10天至产孢旺盛。
- 用含0.05%吐温-80的无菌水洗脱孢子，经多层无菌纱布过滤去除菌丝体。
- 使用血球计数板在光学显微镜下精确计数孢子浓度。
- 用含0.05%吐温-80的无菌水将母液稀释至目标试验浓度梯度：1×10⁴ 孢子/mL、1×10⁵ 孢子/mL、1×10⁶ 孢子/mL、1×10⁷ 孢子/mL。以含0.05%吐温-80的无菌水作为空白对照（CK）。
2.3 试验处理
- 采用浸渍法处理：将金针虫幼虫分别浸入配制好的各浓度孢子悬浮液及对照液中，轻微震荡10秒后取出，用无菌滤纸吸去多余水分。
- 处理后的幼虫单头移入底部铺有湿润滤纸的无菌培养皿（直径9cm）中，每皿1头虫。每处理浓度设3个重复，每重复30头虫。
- 培养皿置于人工气候箱中培养，条件设定为：温度25±1℃，相对湿度85%±5%，光周期L:D = 12h:12h。
- 每日观察幼虫存活状态，根据其对外界刺激（毛笔轻触）有无反应判定死亡。及时移除死亡个体并记录数量。记录处理后第3、5、7、10、14天的累计死亡数。
2.4 数据统计与分析
- 死亡率计算： 死亡率(%) = (死亡虫数 / 供试总虫数) × 100%
- 校正死亡率计算： 校正死亡率(%) = [(处理组死亡率 - 对照组死亡率) / (1 - 对照组死亡率)] × 100% (Abbott公式)
- 致死中浓度(LC₅₀)计算： 采用概率单位分析法(Probit Analysis)，利用SPSS软件建立浓度对数与死亡概率单位之间的回归方程，计算LC₅₀值及其95%置信区间。
- 致死中时间(LT₅₀)计算： 选取最高浓度组数据（1×10⁷ 孢子/mL），同样采用概率单位分析法计算LT₅₀值及其95%置信区间。
- 所有数据以平均值±标准误表示，采用SPSS软件进行差异显著性分析（ANOVA），显著性水平设为α=0.05。
3. 结果与分析
3.1 不同菌株及浓度对金针虫死亡率的影响
- 两种生防菌株均对金针虫幼虫表现出显著的致病致死作用（见表1）。随着孢悬液浓度的升高和侵染时间的延长，金针虫的累计死亡率均显著上升。
- 在最高浓度（1×10⁷ 孢子/mL）处理14天后，球孢白僵菌BB-ARSEF 2860处理的校正死亡率达到92.5%，显著高于金龟子绿僵菌MA-ARSEF 3297处理的85.7% (p<0.05)。
- 对照组（仅含吐温-80的无菌水）在处理14天后平均累计死亡率仅为5.3%，显著低于所有处理组（p<0.01）。
表1：不同生防菌株及浓度处理14天后金针虫幼虫的死亡率及校正死亡率
| 菌株 | 孢子浓度 (孢子/mL) | 平均死亡率 (%) | 校正死亡率 (%) |
|---|---|---|---|
| 球孢白僵菌 BB-ARSEF 2860 | 1×10⁷ | 93.3±1.7 a | 92.5±1.8 a |
| 1×10⁶ | 80.0±2.2 b | 78.8±2.3 b | |
| 1×10⁵ | 55.6±3.3 c | 53.2±3.5 c | |
| 1×10⁴ | 27.8±2.4 d | 23.8±2.5 d | |
| 金龟子绿僵菌 MA-ARSEF 3297 | 1×10⁷ | 87.8±2.0 A | 85.7±2.1 A |
| 1×10⁶ | 72.2±2.8 B | 70.7±2.9 B | |
| 1×10⁵ | 46.7±2.9 C | 43.8±3.0 C | |
| 1×10⁴ | 21.1±2.1 D | 16.7±2.2 D | |
| 对照组 (CK) | 5.3±0.9 | - | |
| 注：同列数据后不同小写字母表示不同菌株同浓度间差异显著(p<0.05)；同列数据后不同大写字母表示同一菌株不同浓度间差异显著(p<0.05)。 |
3.2 时间-死亡率动态变化
- 两种菌株侵染均表现出典型的剂量效应和时间效应（见图1）。低浓度（1×10⁴， 1×10⁵ 孢子/mL）下，死亡主要发生在处理后的7-14天。高浓度（1×10⁶， 1×10⁷ 孢子/mL）下，死亡进程明显加快，第5-7天即可观察到大量死亡。
- 在最高浓度下，球孢白僵菌BB-ARSEF 2860表现出更快的致死速度。其LT₅₀值为6.8天（95% CI: 6.4-7.3天），显著短于金龟子绿僵菌MA-ARSEF 3297的LT₅₀值8.5天（95% CI: 7.9-9.2天）(p<0.05)。
(图1：不同浓度球孢白僵菌BB-ARSEF 2860(A)和金龟子绿僵菌MA-ARSEF 3297(B)处理下金针虫幼虫的累计死亡率时间进程变化曲线图）
3.3 致死中浓度(LC₅₀)比较
- 概率单位分析结果显示（见表2），两种菌株对金针虫均表现出较高的毒力。
- 球孢白僵菌BB-ARSEF 2860的LC₅₀值（处理14天）为6.3×10⁵ 孢子/mL（95% CI: 5.4×10⁵ - 7.4×10⁵ 孢子/mL）。
- 金龟子绿僵菌MA-ARSEF 3297的LC₅₀值（处理14天）为1.1×10⁶ 孢子/mL（95% CI: 9.2×10⁵ - 1.3×10⁶ 孢子/mL）。
- 球孢白僵菌BB-ARSEF 2860的LC₅₀值显著低于金龟子绿僵菌MA-ARSEF 3297 (p<0.05)，表明其对金针虫的相对毒力更高。
表2：生防菌株对金针虫幼虫（处理后14天）的毒力回归方程及LC₅₀值
| 菌株 | 毒力回归方程 (Y=) | χ² 值 | LC₅₀ (孢子/mL) | 95%置信区间 (孢子/mL) |
|---|---|---|---|---|
| 球孢白僵菌 BB-ARSEF 2860 | Y=1.24 + 1.97X | 2.93 | 6.3×10⁵ | (5.4×10⁵ - 7.4×10⁵) |
| 金龟子绿僵菌 MA-ARSEF 3297 | Y=0.76 + 1.68X | 3.15 | 1.1×10⁶ | (9.2×10⁵ - 1.3×10⁶) |
| 注：Y代表死亡概率单位；X代表孢子浓度对数值(Log10)。χ²值均小于χ²₀.₀₅(df=n-2)，表明回归模型拟合良好。 |
4. 讨论
本研究结果表明，昆虫病原真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株BB-ARSEF 2860和金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌株MA-ARSEF 3297对金针虫幼虫均具有显著的感染致死能力。其致病机理主要涉及孢子附着于虫体、萌发穿透体壁、在血腔中大量繁殖并分泌毒素（如白僵菌素、破坏素等），最终导致寄主死亡。试验观察可见，感病后期死亡虫体多呈现僵硬状态，体表有菌丝或孢子覆盖，呈现典型的僵化病症。
研究结果显示，菌株BB-ARSEF 2860在对金针虫的毒力（LC₅₀值）和致死速度（LT₅₀值）上均优于MA-ARSEF 3297。这种差异可能源于不同菌株在基因型、侵染结构（附着胞）形成效率、分泌酶（几丁质酶、蛋白酶）活性、次级代谢产物（毒素）产量以及对金针虫体表微环境适应性等方面存在固有差异。BB-ARSEF 2860对金针虫表现出的高效致病力使其在研究菌株中更具应用潜力。
值得注意的是，本试验是在室内可控条件下（最适温湿度）完成的，其结果代表了这些菌株的最大致病潜力。田间实际应用效果会受到诸多环境因子（如土壤温湿度、pH值、有机质含量、紫外线强度、降雨冲刷）以及施用方式（如颗粒剂、悬浮液灌根、种子处理）的显著影响。因此，后续研究需在田间环境下进一步验证其防治效果并优化应用策略。同时，应关注其对非靶标生物（尤其是土壤有益生物如蚯蚓、捕食螨及授粉昆虫）的安全性评估。
5. 结论
本研究通过规范的室内毒力测定，证实了昆虫病原真菌球孢白僵菌菌株BB-ARSEF 2860和金龟子绿僵菌菌株MA-ARSEF 3297对金针虫幼虫具有良好的感染致病能力及致死效果。其中，球孢白僵菌BB-ARSEF 2860表现出更高的杀虫活性（较低LC₅₀值）和更快的致死速度（较短LT₅₀值）。研究结果为金针虫的生物防治提供了重要的候选微生物资源及科学依据。后续工作应聚焦于田间应用技术的研发、环境适应性的提升及安全性的系统评价，以推动其在可持续农业害虫综合治理（IPM）体系中的实际应用。
