大肠杆菌体外杀菌活性测试

发布时间：2026-04-16 阅读量：8 作者：生物检测中心

大肠杆菌体外杀菌活性测试方法

摘要： 本方法描述了评估测试物质对大肠杆菌（Escherichia coli）体外杀菌活性的标准步骤。该方法基于细菌悬液与测试物质接触预定时间后，通过中和残留杀菌物质、梯度稀释及平板计数，计算杀菌率或杀灭对数值（Log Reduction Value, LRV），以量化其杀菌效果。该方法适用于评价液态或可溶性物质的杀菌效能。

关键词： 大肠杆菌；杀菌活性；体外测试；接触时间；平板计数；杀菌率；杀灭对数值

一、引言

大肠杆菌（Escherichia coli）是革兰氏阴性杆菌的代表菌种，广泛存在于环境和肠道中，某些致病株可引起严重感染。评价化学物质、消毒剂、抗菌材料或天然提取物对大肠杆菌的体外杀灭能力，对于公共卫生、食品卫生、医疗器械消毒及新型抗菌剂研发至关重要。本方法旨在提供一种标准化、可重复的体外杀菌活性测试流程。

原理： 将一定浓度的大肠杆菌悬液与测试物质在特定条件下接触规定时间。到达预定时间点后，立即加入中和剂终止杀菌物质的持续作用，并中和其残留活性。随后将处理后的悬液进行系列梯度稀释，取稀释液涂布于固体培养基平板。经培养后，计数存活菌落形成单位（CFU），与未经处理的对照组（通常为生理盐水或缓冲液处理）比较，计算杀菌率或杀灭对数值，以评价测试物质的杀菌效能。

二、材料与试剂

  1. 测试菌株： 大肠杆菌（Escherichia coli）标准菌株（如ATCC 25922或其它公认标准株）。
  2. 培养基：
    • 营养肉汤培养基： 用于菌种活化及制备菌悬液。
    • 营养琼脂培养基： 用于倾注平板或涂布平板，进行菌落计数。
  3. 稀释液： 无菌生理盐水（0.85-0.90% w/v NaCl）或磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.2-7.4）。
  4. 测试物质： 待评价的具有潜在杀菌活性的溶液或样品提取液（需预先溶解或稀释至所需浓度）。
  5. 中和剂： 根据测试物质特性选择，确保能有效中和其残留杀菌活性且对细菌无毒或低毒（常用如硫代硫酸钠溶液适用于中和卤素类消毒剂；卵磷脂-吐温80溶液适用于中和季铵盐类、酚类等；过滤除菌的中和肉汤）。中和剂的选择及中和效果验证是实验成败的关键。
  6. 阳性对照： 已知有效浓度的标准杀菌剂溶液（如次氯酸钠溶液）。
  7. 阴性对照： 无菌生理盐水或PBS代替测试物质。
  8. 仪器与耗材：
    • 恒温培养箱（37±1℃）
    • 恒温水浴锅（控制接触温度，通常25±1℃或37±1℃）
    • 振荡混合器
    • 无菌移液器及无菌吸头（或无菌刻度吸管）
    • 无菌试管
    • 无菌培养皿
    • 无菌涂布棒或L棒
    • 微量移液器及无菌枪头
    • 菌落计数器或自动计数仪
    • 计时器
 

三、实验步骤

（一）菌悬液制备 (Day 1)

  1. 从新鲜培养（37℃, 18-24小时）的大肠杆菌营养琼脂平板上挑取单菌落，接种于装有营养肉汤的试管中。
  2. 37℃振荡（150-200 rpm）培养18-24小时，获得新鲜稳定的对数后期培养物（此步获得种子液）。
  3. 取适量种子液接种于新鲜营养肉汤中（接种量约1%，v/v），37℃振荡培养至对数生长期中期（通常培养2-4小时，需通过预实验确定最佳培养时间，OD600nm≈0.3-0.6）。
  4. 取对数期培养物，以无菌生理盐水或PBS洗涤菌体2次（离心条件如：3000-4000 rpm, 10分钟），最后重悬于无菌生理盐水或PBS中，调整菌液浓度至约1×10^8 - 5×10^8 CFU/mL（相当于0.5麦氏浊度标准）。此为工作菌悬液。菌悬液浓度需通过平板计数法准确标定（见下述步骤）。
 

（二）接触杀菌试验 (Day 2)

  1. 预温： 将测试物质工作液（所需浓度）、中和剂、稀释液、阴性对照（生理盐水/PBS）置于恒温水浴锅中（如25±1℃）预温至少15分钟。
  2. 接触反应：
    • 取无菌试管，标记好时间点（如0.5 min, 1 min, 5 min, 10 min等）和组别（阴性对照、阳性对照、测试样品）。
    • 各试管中加入9 mL预温的测试物质工作液（阴性对照管加入9 mL预温的生理盐水/PBS；阳性对照管加入9 mL预温的阳性对照溶液）。
    • 迅速在各试管中加入1 mL预温的工作菌悬液（此时菌浓度约为初始浓度的1/10，即1×10^7 - 5×10^7 CFU/mL），立即启动计时器，并剧烈振荡混匀15秒。
    • 将试管置于恒温水浴锅中保温。
  3. 终止反应与中和：
    • 到达预定接触时间点（t）时，立即从相应试管中吸取1 mL反应混合液，加入到含有9 mL预温中和剂的试管中（中和剂体积需按比例调整以确保中和完全），立即充分振荡混匀。
    • 注意： “0 min接触”对照组（仅考察操作过程对菌的影响）：将1 mL工作菌悬液直接加入到含有9 mL中和剂的试管中（省略加入测试物质步骤），混匀。
  4. 梯度稀释：
    • 将中和后的混合液（包括“0 min”、各时间点t、阴性对照终点）进行系列10倍梯度稀释（如10^0, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4等），使用预温的无菌生理盐水或PBS作为稀释液。稀释级数需根据预期杀菌效果确定。
  5. 平板接种与培养：
    • 选择2-3个适宜的稀释度（通常预期有30-300个菌落），取0.1 mL稀释液分别滴加到预先标记好的营养琼脂平板上。
    • 用无菌涂布棒将菌液均匀涂布于整个琼脂表面（注意避免划破琼脂）。
    • 待菌液完全被琼脂吸收后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中，培养18-24小时（或根据标准至48小时）。
    • 阴性对照管终点（测试物质+菌液，接触时间结束时取样中和、稀释、涂板）用来检测中和剂是否有效中和了测试物质残留活性（理论上应无明显杀菌效果）。
 

（三）菌落计数与计算 (Day 3 or 4)

  1. 计数各平板上长出的典型大肠杆菌菌落数（CFU）。菌落数在30-300之间的平板为有效计数平板。每个稀释度平行做至少2个平板。
  2. 计算每个时间点（包括“0 min”和阴性对照终点）以及阳性对照的平均CFU/mL。
    • 平均CFU/mL = (同一稀释度各平板菌落数之和 / 平板数) × 稀释倍数 × 10 （因涂布量为0.1 mL）
  3. 计算杀菌率或杀灭对数值：
    • 杀菌率 (%)：
      杀菌率 = [(N₀ - Nₜ) / N₀] × 100%
      • N₀： “0 min”接触对照组的平均存活菌浓度（CFU/mL）。
      • Nₜ： 接触时间 t 后测试样品组的平均存活菌浓度（CFU/mL）。
    • 杀灭对数值 / LRV：
      LRV = log₁₀(N₀) - log₁₀(Nₜ)
      • log₁₀(N₀)： “0 min”接触对照组的平均存活菌浓度的以10为底的对数值。
      • log₁₀(Nₜ)： 接触时间 t 后测试样品组的平均存活菌浓度的以10为底的对数值。
      • 意义： LRV≥4（即杀菌率≥99.99%）通常被认为具有强烈的杀菌效果（相当于杀灭99.99%的细菌）。LRV≥5（杀菌率≥99.999%）为高效杀菌。
 

（四）结果判定（示例）

  • 阴性对照终点：菌落数应与“0 min”对照接近，证明中和剂有效且无毒。
  • 阳性对照：在规定时间内应达到显著杀菌效果（如LRV≥5），验证试验系统有效。
  • 测试样品：报告不同接触时间下的杀菌率或LRV。通常认为在规定时间内达到LRV≥3（杀菌率≥99.9%）即具有较好的杀菌效果。
 

四、质量控制

  1. 菌悬液浓度： 每次实验前必须进行平板计数准确标定工作菌悬液浓度。
  2. 中和剂验证： 必须通过实验验证所选中和剂能有效中和测试物质残留活性，且本身及其终产物对大肠杆菌无明显毒性或促生长作用（如阴性对照终点菌落数与“0 min”对照差异应不显著）。
  3. 阳性对照： 每次实验必须设置阳性对照，确保实验系统有效。
  4. 平行重复： 每个实验组（包括测试样品各时间点、阴性对照、阳性对照）至少应进行3次独立的平行实验（生物学重复），确保结果可重复性。
  5. 无菌操作： 整个过程严格遵循无菌操作规范，防止杂菌污染。
  6. 温度控制： 接触反应温度需精确控制并记录。
  7. 计时精确： 接触时间的起点和终点需精确控制。
 

五、注意事项

  1. 安全性： 大肠杆菌虽为条件致病菌，操作仍需在生物安全柜（II级）中进行，遵守微生物实验室安全规范。废弃物需高压灭菌处理。
  2. 中和剂关键性： 中和剂选择不当或中和不彻底是导致假阴性或假阳性结果的最常见原因。
  3. 接触均一性： 加入菌悬液后必须立即充分振荡混匀，确保菌体与测试物质充分接触。
  4. 时效性： 终止反应（加入中和剂）以及后续稀释、涂布操作应迅速进行。
  5. 浓度单位： 最终计算结果应清晰标明其单位（CFU/mL）和计算方法。
  6. 报告详细参数： 实验报告需详细记录接触时间、温度、初始菌浓度、测试物质浓度、所用中和剂及验证结果、每次实验的平行数据及最终平均值±标准差。
  7. 方法局限性： 此方法主要评估悬浮状态细菌的杀灭效果。对于评估材料表面抗菌活性、生物膜杀菌效果或孢子杀灭效果（大肠杆菌不产孢），需采用其他专门方法。
 

六、参考文献

  1. European Committee for Standardization (CEN). Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of bactericidal activity in the medical area - Test method and requirements (phase 2, step 1). EN 1040: 2005.
  2. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Eleventh Edition. CLSI document M07-A11. Wayne, PA: CLSI; 2018. (虽主要针对MIC，但稀释和计数原则可参考)。
  3. Block, S. S. (Ed.). Disinfection, Sterilization, and Preservation (5th ed.). Lippincott Williams & Wilkins; 2001.
  4. 中华人民共和国国家标准. GB/T 38502-2020 消毒剂实验室杀菌效果检验方法.
  5. Maillard, J.-Y., & Sattar, S. A. (Eds.). Russell, Hugo & Ayliffe’s Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization (5th ed.). Wiley-Blackwell; 2013.
 

结论： 本方法提供了一种标准化、可靠的体外评价测试物质对大肠杆菌杀菌活性的途径。通过严格控制实验条件（菌浓度、接触时间、温度、中和剂）、设立必要的对照并进行平行重复实验，可以获得具有可比性的杀菌率或杀灭对数值数据，为评价杀菌物质的效能提供科学依据。严格遵守操作规程和质量控制措施是确保实验结果准确性和可靠性的关键。

底部图片-PC版 底部图片-移动版