细胞流式分析实验

发布时间：2026-04-16 阅读量：14 作者：生物检测中心

细胞流式分析实验完整指南

细胞流式分析（Flow Cytometry）是一种强大的单细胞分析技术，能够在短时间内高速、多参数地检测悬浮液中单个细胞的物理和化学特性。它在免疫学、肿瘤学、干细胞研究、药物开发等领域发挥着不可替代的作用。

一、实验原理

核心原理是利用流体动力学聚焦技术，迫使细胞悬液在鞘液的包裹下形成单列细胞流，高速通过激光检测区。当细胞经过激光束时，会产生两种主要信号：

  1. 散射光信号：
    • 前向散射光： 反映细胞的大小和相对体积。
    • 侧向散射光： 反映细胞的内部复杂程度、颗粒性、细胞核大小等形态信息。
  2. 荧光信号：
    • 细胞若被特异性荧光染料标记（如荧光标记的抗体、核酸染料、活性染料、离子指示剂、荧光蛋白等），受激发光照射后会发射特定波长的荧光。
    • 仪器配备多个光电倍增管，配备不同波长的滤光片，可同时检测多种荧光信号，实现多参数分析。
 

二、实验材料与试剂

  • 细胞样本： 外周血单个核细胞、培养的贴壁或悬浮细胞、组织消化后的单细胞悬液、骨髓细胞、胸腺细胞、淋巴结细胞等。关键要求： 必须制备成单细胞悬液，无明显细胞团块或碎片。
  • 荧光标记探针：
    • 荧光抗体： 用于检测细胞表面或胞内/核内特异性抗原（蛋白）。需根据目标抗原选择合适的抗体克隆和荧光染料。
    • 荧光染料： 核酸染料（如PI, 7-AAD, DAPI - 检测DNA含量/细胞周期/死细胞）、细胞活性染料（如Live/Dead染料）、钙离子指示剂、活性氧指示剂、荧光染料偶联配体等。
  • 缓冲液：
    • 磷酸盐缓冲液： 用于洗涤细胞和稀释抗体。
    • 染色缓冲液： 通常含1-2%胎牛血清或牛血清白蛋白的PBS，用于封闭非特异性结合位点和稀释抗体。
    • 固定液： 如多聚甲醛溶液，用于固定细胞（尤其胞内染色后）。
    • 破膜/透化液： 用于胞内/核内抗原染色。
  • 其他耗材： 流式上样管、离心管、移液器及枪头、冰盒、计时器、细胞过滤筛网（常用70μm或40μm）。
  • 主要仪器： 流式细胞仪（包含液流系统、光学系统、电子系统和计算机控制系统）。
 

三、实验步骤（以细胞表面抗原染色为例）

  1. 样本制备：

    • 血液：密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。
    • 组织：机械破碎法或酶消化法（如胶原酶、胰酶）获得单细胞悬液。
    • 培养细胞：贴壁细胞需胰酶消化（含EDTA），悬浮细胞直接收集。所有样本需用PBS洗涤1-2次（离心，如300-400g，5分钟），去除杂质。
    • 细胞计数：调整细胞浓度至1x10^6至1x10^7个细胞/mL（根据实验需求）。

  2. 封闭（可选但推荐）：

    • 将适量细胞重悬于含1-2% Fc受体阻断剂的染色缓冲液中（如纯化的抗CD16/CD32抗体），冰上孵育10-15分钟，减少抗体非特异性结合。

  3. 细胞表面染色：

    • 直接法： 离心弃上清后，将细胞重悬于预先用染色缓冲液稀释好的荧光标记一抗中。充分混匀，避光冰上孵育20-30分钟。
    • 间接法： 先用未标记的一抗孵育细胞（同上），洗涤后（PBS洗涤1-2次），再用荧光标记的二抗孵育（同上）。增加步骤但可放大信号。
    • 抗体滴定： 强烈建议每次使用新抗体（尤其是新批次）时进行抗体滴定优化实验，确定最佳使用浓度（信噪比最高、非特异结合最少的浓度）。

  4. 洗涤：

    • 加入足量PBS（至少是染色体积的3-5倍），充分混匀。
    • 离心（如300-400g，5分钟），仔细弃上清（避免损失细胞沉淀）。重复洗涤1-2次，彻底去除未结合的抗体/染料。

  5. 细胞活力染料染色（可选，推荐）：

    • 洗涤后，将细胞重悬于含合适浓度细胞活力染料（如Fixable Viability Dye）的PBS中，避光冰上孵育10-15分钟。随后用PBS洗涤一次。
    • 或在染色最后一步加入核酸染料（如PI或7-AAD），孵育5-10分钟（此时无需洗涤，直接上机分析）。

  6. 细胞固定（可选）：

    • 如果样本不能立即上机或需要进行胞内染色，可将细胞重悬于固定液（如1-4%多聚甲醛/PBS）中，避光室温或4°C孵育15-30分钟。固定后用PBS洗涤一次。
    • 注意： 固定后细胞散射光特性可能改变，且部分荧光染料可能受影响。

  7. 胞内/核内染色（如需）：

    • 表面染色、洗涤、固定后，用预冷的透化/破膜缓冲液洗涤细胞。
    • 将细胞重悬于透化/破膜缓冲液中孵育（时间、温度按说明书），使细胞膜通透。
    • 离心弃上清，加入用透化缓冲液稀释好的荧光抗体或染料（针对胞内/核内靶标），避光孵育（通常室温或4°C，30-60分钟）。
    • 用透化缓冲液洗涤1-2次，再用PBS洗涤一次。

  8. 重悬与过滤：

    • 将最终洗涤后的细胞沉淀用适量PBS或流式上样缓冲液重悬（浓度适合仪器要求，通常0.5-1x10^6个细胞/100μL）。
    • 将细胞悬液通过细胞过滤筛网转移至流式上样管中，去除可能的团块或杂质，防止堵塞仪器管路。

  9. 流式细胞仪上样与分析：

    • 打开流式细胞仪，预热激光器，进行初始化、光路校准（如适用）和性能质控（使用标准微球）。
    • 设置实验方案：
      • 创建散点图、等高线图或直方图等图形。
      • 设置参数：FSC, SSC，以及各个荧光通道（如FL1, FL2, FL3...对应不同荧光染料）。
      • 设置阈值：通常设置FSC阈值以排除微小碎片。
      • 补偿调节： 至关重要的一步！ 当使用多色荧光时，不同荧光染料的光谱存在重叠（溢漏），需用单染样本（单个荧光染料标记的样本或补偿微球） 精确设置荧光补偿矩阵，确保每个通道检测的信号仅来源于其对应的荧光染料。
    • 上样：将样本管置于进样器或手动上样。
    • 数据采集：设定需要收集的细胞事件数（通常每个样本至少收集10,000个目的细胞）。
    • 数据保存：保存原始数据文件。
 

四、数据分析

  1. 数据预处理： 使用专业流式数据分析软件打开原始数据文件。
  2. 设门策略：
    • 第一步： 在FSC-A vs SSC-A图上，圈出目标细胞群（如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞），排除碎片和死细胞（高SSC, 低FSC）。
    • 第二步： 排除粘连体：利用FSC-A vs FSC-H图（或SSC-A vs SSC-H），圈出单个细胞，排除双联体或多联体细胞。
    • 第三步： 排除死细胞：如果在染色中加入了活力染料，在相应的荧光通道（如检测PI或7-AAD）vs SSC图上，圈出活力染料阴性细胞（活细胞）。
    • 第四步及后续： 在目标活细胞群内，利用不同荧光通道的组合（如CD3 vs CD4），进一步细分细胞亚群（如CD3+ CD4+ T细胞），并可分析目标抗原的表达强度（平均荧光强度）。
  3. 结果呈现：
    • 通过统计各细胞亚群的百分比。
    • 分析特定标记的平均荧光强度。
    • 绘制图形：散点图、等高线图、直方图、叠加直方图等。
    • 进行统计学分析（如多组间比较）。
 

五、应用

细胞流式分析应用极其广泛，包括但不限于：

  • 免疫表型分析： 鉴定和量化血液、淋巴组织或炎症部位中的免疫细胞亚群（如T/B/NK细胞及其亚型）。
  • 细胞周期与增殖分析： 检测细胞内DNA含量，分析细胞周期时相分布（G0/G1, S, G2/M）。
  • 细胞凋亡与死亡检测： 检测早期凋亡（磷脂酰丝氨酸外翻-Annexin V）、晚期凋亡/坏死（膜完整性丧失）、线粒体膜电位变化、Caspase酶活化等。
  • 胞内因子与信号转导分析： 检测细胞因子（刺激后）、磷酸化蛋白（如pSTAT, pERK）、转录因子等。
  • 干细胞分析： 鉴定干细胞/祖细胞表面标志物。
  • 功能检测： 检测活性氧、钙离子流、pH值、膜电位等。
  • 细胞分选： 特定仪器（流式细胞分选仪）可根据设定参数分选纯化目标细胞群。
 

六、注意事项

  1. 单细胞悬液质量： 是实验成功的基础。避免细胞团块、过多碎片或粘稠物质。
  2. 抗体选择与滴定： 选择经过验证、特异性高的抗体克隆。务必进行抗体滴定优化，特别是多色实验。 注意抗体的交叉反应性。
  3. 荧光染料选择：
    • 考虑仪器的激光器和滤光片配置。
    • 考虑不同荧光染料发射光谱的重叠程度，合理搭配，尽量减少补偿需求。
    • 注意染料对固定/透化的耐受性。
    • 注意串联染料的稳定性。
  4. 补偿调节： 多色实验成败的关键！ 必须使用单染对照（最好是补偿微球）进行准确补偿设置。补偿不当会导致假阳性或假阴性结果。
  5. 对照设置：
    • 阴性对照/同型对照： 用于设定阳性/阴性的分界。
    • 荧光减一对照： 在多色实验中，每个荧光通道设置一个缺少该通道染料的样本，用于精确设门和评估自发荧光/渗漏。
    • 生物学对照： 包括阳性对照（已知表达目标抗原的细胞）和阴性对照（已知不表达目标抗原的细胞）。
    • 未染色对照： 用于评估细胞的自发荧光水平。
    • 补偿对照： 单染样本或补偿微球。
  6. 细胞浓度与上样速度： 过高的浓度或上样速度可能导致细胞堵塞管路或检测误差（如粘连体增加）。
  7. 实验方案设计： 特别是多色实验，遵循“最小化补偿需求”的原则，合理分配荧光染料到不同通道。
  8. 仪器维护与质控： 定期进行性能验证和校准，确保仪器状态稳定可靠。
  9. 数据记录与分析： 详细记录实验条件、抗体信息、染色方案、仪器设置等。数据分析时采用逻辑清晰的设门策略，避免主观偏倚。
  10. 生物安全： 处理人类来源或其他潜在传染性样本时，严格遵守生物安全规定，在相应等级的实验室操作，使用个人防护装备，废弃物按规定处理。
 

七、总结

细胞流式分析是一种功能强大且高度灵活的单细胞分析技术。成功的关键在于细致的实验设计、严格的样本制备、优化的染色方案、准确的仪器操作补偿设置以及合理的数据分析策略。熟练掌握其原理和应用，结合严谨的科学态度，研究者能够深入揭示细胞的多样性和复杂性，为生命科学和医学研究提供宝贵的数据。

参考文献

  1. Cossarizza, A., et al. (2019). Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology, 49(10), 1457–1973. (权威指南)
  2. Shapiro, H. M. (2003). Practical Flow Cytometry (4th ed.). Wiley-Liss. (经典教材)
  3. McKinnon, K. M. (2018). Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology, 120(1), 5.1.1-5.1.11. (基础概述)
  4. Maecker, H. T., McCoy, J. P., & Nussenblatt, R. (2012). Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews Immunology, 12(3), 191–200. (多色流式标准化)
  5. Roederer, M. (2001). Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry, 45(3), 194–205. (补偿原理与注意事项)
 

(请注意：此指南旨在提供一个通用的实验框架和重要注意事项。具体实验方案应根据研究目的、样本类型和所用试剂/仪器的说明书进行详细优化。)

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