细胞表面受体表达实验

发布时间：2026-04-16 阅读量：36 作者：生物检测中心

细胞表面受体表达检测实验方案

摘要：
本方案详细描述了体外定量分析细胞表面受体表达的标准化流程，主要基于荧光标记抗体技术与流式细胞术。该方案适用于多种细胞类型，包括原代细胞与细胞系，为研究细胞表面受体在不同生理病理状态下的表达变化提供可靠的技术支持。

一、 引言
细胞表面受体是细胞感知外界信号并启动胞内反应的关键分子。其表达水平受发育阶段、细胞活化状态、疾病进程及药物治疗等多种因素调控。精确检测细胞表面受体的表达量对于理解细胞信号传导、免疫应答、肿瘤发生及药物作用机制等研究至关重要。

二、 实验原理
利用能与目标受体特异性结合的单克隆或多克隆抗体（通常为一抗），经荧光染料标记或偶联后，与待测细胞共同孵育。结合到细胞表面的荧光抗体，其荧光强度与目标受体的表达量正相关。通过流式细胞仪检测单个细胞的荧光信号，可对细胞群体中目标受体的表达水平进行精确定量（平均荧光强度，MFI）及表达阳性细胞百分比的统计分析。

三、 实验材料与试剂

  1. 细胞样本： 待检测的细胞悬液（例如：外周血单核细胞PBMCs、培养的细胞系、组织分离细胞等）。细胞状态良好，活率需>90%。
  2. 荧光标记抗体： 针对目标细胞表面受体的荧光素直接标记抗体（如FITC, PE, APC, PerCP-Cy5.5, BV系列等）。选择经验证适用于流式细胞术、种属匹配的抗体。优化使用浓度（通常建议按制造商推荐起始浓度进行滴定优化）。
  3. 同型对照抗体： 与一抗相同种属、相同亚型、相同荧光标记的非特异性免疫球蛋白。用于区分非特异性结合背景与特异性信号。浓度与实验抗体一致。
  4. FMO对照（Fluorescence Minus One）： 在包含所有荧光标记抗体组合的多色实验中，逐一缺少其中一种目标抗体的样品管。用于设门时确定该荧光通道的阴性背景界值。
  5. 染色缓冲液： 含1-2%胎牛血清(FBS)或牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)。用于稀释抗体和洗涤细胞。可添加0.1%叠氮化钠抑制细胞代谢（仅限体外实验）。
  6. 封闭试剂（可选）： 正常血清（与二抗种属相同，如使用间接法）或纯化的Fc受体阻断剂（如抗CD16/32抗体），用于阻断细胞表面的Fc受体，减少非特异性结合。
  7. 固定液（可选）： 如果需要延迟上机检测或进行胞内染色，需使用多聚甲醛等细胞固定液。
  8. 活力染料： 用于区分活细胞与死细胞（死细胞常因非特异性结合导致背景升高），如7-AAD、DAPI、PI（碘化丙啶）或膜渗透性差的活力染料（如Fixable Viability Dye - FVD）。
  9. 实验耗材： 流式管（如5ml圆底聚苯乙烯管）、移液器及无菌吸头、离心机、涡旋振荡器、冰盒、计时器。
  10. 流式细胞仪。
 

四、 实验步骤

(一) 样本制备

  1. 收集待测细胞，制备成单细胞悬液。贴壁细胞需用无酶细胞解离液温和消化。
  2. 洗涤细胞：加入适量（如2-5ml）预冷的染色缓冲液，轻柔重悬细胞。
  3. 离心：根据细胞类型选择合适的离心力（通常200-400 × g）和时间（5-10分钟），弃上清。重复洗涤1-2次。
  4. 计数：使用血球计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
  5. 调整细胞浓度：用染色缓冲液重悬细胞至所需浓度（通常1×10^6至1×10^7 cells/ml）。
 

(二) 封闭（如需要）

  1. 将适量体积（如50-100μl）的细胞悬液（含1×10^5至1×10^6个细胞）分装到流式管中。
  2. 加入适量封闭试剂（如纯化的Fc受体阻断剂，按说明书推荐浓度稀释；或2-5%正常血清），混匀。
  3. 冰上或4°C孵育10-15分钟。
 

(三) 抗体标记

  1. 直接标记法（推荐）：
    • 根据实验设计（单色或多色），在相应流式管中加入荧光标记的抗体（通常每管细胞加入0.5-5μg抗体或按优化体积加入）。同时设立：
      • 未染色对照管： 仅加细胞和缓冲液。
      • 同型对照管： 加入荧光标记的同型对照抗体。
      • FMO对照管（多色实验必需）： 包含除目标抗体外其他所有荧光标记抗体的混合液。
    • 涡旋混匀。
    • 避光！ 冰上或4°C孵育20-30分钟（具体时间需优化或按抗体说明书）。避免长时间孵育导致抗体非特异性结合增加。
  2. 间接标记法（较少用于表面染色）：
    • 加入未标记的一抗，冰上孵育。
    • 洗涤细胞2次去除未结合一抗。
    • 加入荧光标记的二抗，冰上避光孵育。
    • 洗涤细胞2次去除未结合二抗（此步必需，否则背景高）。
 

(四) 洗涤去除未结合抗体

  1. 每管加入2-5ml预冷的染色缓冲液。
  2. 离心（200-400 × g, 5-10分钟，4°C）。
  3. 小心弃上清，避免损失细胞沉淀。可轻轻敲击管壁或用真空吸液器小心吸取。
  4. 重复洗涤步骤1次。
 

(五) 死细胞染色（如需要）

  1. 用适量（如100-200μl）染色缓冲液或PBS重悬细胞沉淀。
  2. 加入活力染料（如7-AAD, PI, 或FVD），按说明书推荐浓度和体积加入。
  3. 涡旋混匀。
  4. 避光！ 室温或冰上孵育5-15分钟（具体时间依据染料类型）。
  5. 如使用非固定兼容的染料（如PI, 7-AAD）：加入少量缓冲液重悬细胞（约200-300μl），立即上机检测。
  6. 如使用固定兼容的FVD：按步骤(六)进行固定。
 

(六) 固定（可选）

  1. 仅当需要延迟上机（>2小时）或后续进行胞内染色时进行固定。固定会改变细胞光散射特性并可能影响部分荧光信号。
  2. 用适量（如100-200μl）染色缓冲液或PBS重悬细胞沉淀。
  3. 加入适量体积的固定液（如1-4%多聚甲醛溶液），通常按1:1体积加入（例如100μl细胞悬液加100μl 2%多聚甲醛，最终浓度~1%）。
  4. 涡旋混匀。
  5. 避光！ 室温或4°C孵育10-20分钟。
  6. 离心去除固定液（离心力可适当降低）。
  7. 用染色缓冲液或PBS洗涤细胞1-2次。
  8. 用适量缓冲液（如200-500μl）重悬细胞，4°C避光保存（通常可稳定24-48小时）。
 

(七) 上机检测

  1. 使用流式细胞仪前，确保仪器已校准（如使用校准微球），各激光器和检测通道工作正常。
  2. 根据荧光染料选择相应的激光器和滤光片组合。
  3. 优化仪器设置（电压、增益、补偿）：
    • 使用未染色细胞调节各通道的电压（FSC, SSC及荧光通道），使细胞群落在合适的信号范围内。
    • 补偿调节（多色实验必需）： 使用单染管或补偿微球，测量各荧光染料之间的溢出信号（尤其光谱重叠严重的染料对），并在软件中设置补偿矩阵进行校正。
  4. 依次检测各样品管（未染色、同型对照、FMO对照、实验样品）。
  5. 设定合适的阈值（如FSC/SSC）排除碎片。
  6. 收集足够数量的事件（通常建议至少10,000个目的细胞群体事件）。
 

五、 数据分析

  1. 设门策略(Gating Strategy)：
    • 利用FSC-A和SSC-A散点图区分细胞（淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等）并圈选目的细胞群（如淋巴细胞）。
    • 利用FSC-A/FSC-H或FSC-A/SSC-A去除粘连体（Doublets）。
    • 利用活力染料通道去除死细胞。
    • 关键步骤：
      • 在同型对照管或FMO对照管中，在目标荧光通道上设定阴性细胞群范围（划设阴性门）。 这是区分阴阳性的基础。FMO对照在多色实验中更可靠。
      • 将相同的阴性门位置应用于实验样品管。
  2. 结果量化：
    • 阳性细胞百分比(% Positive)： 位于阴性门上方（即荧光信号高于背景阈值）的细胞占分析细胞总数的比例。这是最常用的指标。
    • 平均荧光强度(Mean Fluorescence Intensity, MFI)： 目标细胞群体（通常指阳性细胞群）在相应荧光通道的平均荧光强度值。反映受体表达量的高低。报告中需注明是阳性群MFI还是总体MFI（Gated MFI vs. Total MFI）。
    • 荧光强度比值（Fold Change in MFI）： 相对于对照样本（如未刺激细胞、同型对照背景）的MFI比值（实验组MFI / 对照组MFI）。
    • 几何平均荧光强度(Geometric Mean)： 对于荧光分布呈现偏态的数据，几何均值有时比算术均值更合适。
  3. 图形展示：
    • 直方图(Histogram)：直观显示单个荧光通道的信号分布，便于比较不同样品或不同处理组之间的表达差异，观察同型对照/实验样品的对比。
    • 散点图(Dot Plot)或等高线图(Contour Plot)：展示两个荧光参数的相关性（如双阳性细胞）。
    • 统计图表：展示不同处理组间阳性细胞百分比和/或MFI的差异（如柱状图加误差线）。
 

六、 质量控制与注意事项

  1. 细胞活性： 实验全程保持低温操作（冰上或4°C）以减少抗体结合后内化(internalization)。使用高活性细胞（活率>90%）。死细胞必须有效排除。
  2. 抗体优化： 至关重要！ 务必对抗体浓度和孵育时间进行预实验优化（滴定实验）。过低浓度导致信号弱，过高浓度增加非特异性结合。查阅抗体说明书推荐起始浓度。
  3. 对照设置：
    • 未染色对照： 检测细胞自发荧光。
    • 同型对照/FMO对照： 区分非特异性结合与特异性信号的核心依据。 FMO对照在多色实验中更准确可靠。
    • 阳性对照： 已知表达目标受体的细胞系或激活状态的细胞。
  4. 去除粘连体： 粘连体会导致荧光信号误判，必须严格去除（FSC-A/FSC-H或FSC-A/SSC-A设门）。
  5. 补偿校正： 多色实验中准确解析各荧光信号的前提。 必须使用单染管或补偿微球精确设置补偿矩阵。
  6. 避光操作： 荧光染料易淬灭，抗体孵育及洗涤后所有步骤需严格避光。
  7. 离心条件： 轻柔离心，避免细胞成团或破碎。离心后弃上清动作要轻柔。
  8. 缓冲液： 使用不含钙镁离子的PBS（如DPBS）作为基础缓冲液，以免细胞聚集。添加血清或BSA可减少非特异性结合。
  9. 固定影响： 如需固定，需了解固定剂可能对某些抗原表位或荧光染料信号产生淬灭或增强效应。
  10. 仪器维护： 流式细胞仪需定期维护校准，保证数据的准确性和重现性。
 

七、 应用领域
本方案广泛应用于：

  • 免疫学： T/B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞表面活化标记（CD69, CD25, CD44）、趋化因子受体（CCR7, CXCR4）、抑制/活化受体（PD-1, CTLA-4, CD28, CD137）、细胞亚群标志物（CD4, CD8, CD19, CD56）等的检测。
  • 肿瘤学： 肿瘤细胞表面抗原（如EpCAM, HER2, EGFR）、肿瘤干细胞标志物、免疫检查点分子（PD-L1）等的表达分析。
  • 干细胞研究： 干细胞表面标志物（如CD34, CD133）的鉴定与分选。
  • 信号转导研究： 受体表达水平变化与信号通路激活状态的关系。
  • 药物研发： 评估药物对靶点受体表达的影响（如受体上调/下调、内化）。
 

八、 参考文献 (范例格式)

  1. Shapiro, H. M. (2003). Practical Flow Cytometry (4th ed.). Wiley-Liss. (经典流式细胞术参考书)
  2. Cossarizza, A., et al. (2019). Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology, 49(10), 1457-1973. (权威的流式细胞术标准化指南)
  3. Maecker, H. T., McCoy, J. P., & Nussenblatt, R. (2012). Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews Immunology, 12(3), 191–200. (免疫表型标准化重要文献)
  4. BD Biosciences. BioLegend. Tonbo Biosciences. (注：此处仅示意，实际引用应使用其公开发表的科学论文或技术手册中的具体方法学描述，需替换为具体文献)
 

九、 附录 (可选)

  • 常用荧光染料光谱表。
  • 常用细胞表面受体列表及其功能简介。
  • 离心力×g与rpm对照表（针对常用离心机转子型号）。
 

重要声明： 本方案为通用性技术指南，具体实验条件（如抗体浓度、孵育时间、离心力、固定方法等）需研究者根据不同细胞类型、目标受体特性及所用试剂进行严格优化和验证。实验中使用的所有生物材料需遵守相关伦理规范及生物安全规定。

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