细胞周期分析实验

发布时间：2026-04-16 阅读量：9 作者：生物检测中心

细胞周期分析实验方法（流式细胞术）

摘要： 细胞周期分析是研究细胞增殖状态与调控机制的核心实验技术。本方案基于碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色与流式细胞术，详细描述了从细胞样品制备、固定、染色到流式检测及数据分析的标准化流程，适用于评估细胞群体在细胞周期各时相（G0/G1, S, G2/M）的分布比例。

一、 实验原理

细胞核DNA含量随细胞周期进程呈现周期性变化：

  • G0/G1期： 二倍体DNA含量 (2N)。
  • S期： DNA进行，含量介于2N至4N之间。
  • G2/M期： DNA完成，四倍体DNA含量 (4N)，细胞准备分裂或有丝分裂中。
 

碘化丙啶（PI） 是一种可嵌入双链DNA的荧光染料。其荧光强度与DNA含量呈正比。利用流式细胞术检测单个细胞发出的PI荧光强度，可获得反映细胞群体DNA含量分布的直方图。通过专业软件（如ModFit LT, FlowJo的Dean-Jett-Fox模型等）拟合该直方图，即可计算出处于G0/G1期、S期和G2/M期的细胞百分比（图1）。

图1：典型的细胞周期分布流式直方图示例（X轴：PI荧光强度/ DNA含量；Y轴：细胞数量）
(此处可插入典型图谱示意图，显示G0/G1峰，S期平台，G2/M峰)

二、 实验材料与试剂

  1. 细胞样品： 待检测的细胞系或原代细胞（悬浮细胞或贴壁细胞）。
  2. 磷酸盐缓冲液（PBS）： 无钙镁离子。
  3. 70%预冷乙醇（-20℃保存）： 用于细胞固定。（关键：使用分析纯乙醇，现用现配，保持低温）
  4. PI染色缓冲液：
    • 磷酸盐缓冲液（PBS）
    • PI工作液浓度：通常50 μg/ml（需优化）
    • RNase A：终浓度50-100 μg/ml（关键：消化RNA，避免干扰DNA染色）
    • （可选）0.1% Triton X-100或0.1%柠檬酸钠：增加细胞膜通透性（根据细胞类型优化）。
  5. DNase-free RNase A： 溶解于PBS或水中配制成母液（如10 mg/ml），分装-20℃保存。
  6. PI母液： 溶解于PBS或水中配制成高浓度母液（如1 mg/ml），避光-20℃储存。
  7. 流式管： 专用聚苯乙烯或聚丙烯材质。
  8. 冰盒或4℃冰箱。
  9. 离心机。
  10. 涡旋振荡器。
  11. 移液器及无菌吸头。
  12. 流式细胞仪及配套分析软件。
  13. （针对贴壁细胞）细胞消化液： 如胰蛋白酶-EDTA溶液。
 

三、 实验步骤

（一） 细胞悬液制备

  1. 悬浮细胞：
    • 收集细胞培养液至离心管。
    • 300-500g室温离心5分钟，小心弃上清。
    • 用预冷PBS轻柔重悬细胞沉淀。
    • 重复离心洗涤一次（300-500g, 5 min），弃尽上清。
  2. 贴壁细胞：
    • 弃去培养液。
    • 用预冷PBS轻柔洗涤细胞两次。
    • 加入适量预温（通常37℃）的胰蛋白酶-EDTA溶液（或其他合适消化液）消化细胞。显微镜下观察，待细胞变圆、大部分脱落（避免过度消化）。
    • 加入含血清的完全培养液终止消化。
    • 吹打混匀成单细胞悬液，转移至离心管。
    • 300-500g室温离心5分钟，弃上清。
    • 用预冷PBS轻柔重悬细胞沉淀。
    • 重复离心洗涤一次（300-500g, 5 min），弃尽上清。
 

（二） 细胞固定

  1. 将离心洗涤后弃尽上清的细胞沉淀（约含1x10^6个细胞）置于冰上。
  2. 缓慢加入预冷的70%乙醇（-20℃），同时轻轻涡旋或吹打细胞沉淀（切忌快速加入引起细胞聚集）。 乙醇体积应足以覆盖细胞（通常至少1ml）。
  3. 将固定好的细胞悬液置于-20℃冰箱，固定至少2小时以上（通常4℃过夜固定效果更佳）。固定后细胞可在-20℃保存数周。
 

（三） 细胞染色

  1. 准备染色缓冲液： 根据待测样品数量，用PBS新鲜配制PI染色缓冲液（含50 μg/ml PI 和 50-100 μg/ml RNase A）。避光保存于冰上或4℃。（关键：RNase必须包含）
  2. 从-20℃冰箱取出固定好的细胞样品。
  3. 1500-2000g离心5分钟，小心弃尽乙醇上清（乙醇残留会影响染色）。
  4. 用预冷PBS洗涤细胞沉淀一次（1500-2000g, 5 min），彻底弃尽上清。
  5. 加入适量（通常0.5-1ml）配制好的PI染色缓冲液，轻柔吹打或涡旋重悬细胞沉淀，确保为单细胞悬液。
  6. 避光，室温（或37℃）孵育30分钟。 （孵育时间需优化，确保RNA被充分消化，通常30-60分钟）。
 

（四） 流式细胞术检测

  1. 孵育结束后，样品可立即上机检测（避光）或4℃避光短时保存（建议尽快检测）。
  2. 上机前，样品需经300目（或40μm）尼龙细胞筛网过滤，去除可能存在的细胞团块或杂质。
  3. 开启流式细胞仪，预热激光器（通常使用488nm激发光）。
  4. 设置流式细胞仪参数：
    • 前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）：线性模式，用于初步圈门排除碎片和细胞团块。
    • PI荧光检测通道（通常为FL2或FL3通道，取决于仪器配置）：使用对数模式（Log）或线性模式（Lin），需根据细胞周期峰形调整。常用激发光488nm，发射光收集>620nm（如610/20nm, 695/40nm滤光片）。
    • 调整FSC, SSC, PI的电压（PMT电压）和增益，使G0/G1峰位于合适位置（通常在10^2 - 10^3之间）。
  5. 先运行未染色细胞或仅加PI/RNase缓冲液的阴性对照（如有），调整电压至背景信号在低水平。
  6. 上机检测样品：
    • 设置合适的流速（通常低速，如Low），获取足够数量的事件（通常建议获取10,000 - 20,000个单细胞门内事件）。
    • 使用阈值（Threshold）设定（通常基于FSC或SSC）排除小颗粒噪音。
  7. 记录流式数据文件（.fcs格式）。
 

四、 数据分析

  1. 使用流式分析软件打开.fcs数据文件。
  2. 圈门策略：
    • FSC-A vs SSC-A： 圈出主要细胞群体门（P1），排除碎片和死细胞碎片（通常位于左下角）。
    • FSC-H vs FSC-A： 在P1门内，圈出单细胞门（P2），排除粘连细胞（双联体或多联体会出现在对角线外）。
  3. 细胞周期拟合：
    • 对P2门内的细胞，显示PI-A（荧光强度）的直方图。
    • 应用专门的细胞周期分析模块（如ModFit, FlowJo的Dean-Jett-Fox, Watson模型等）。
    • 设置拟合参数：通常选择二倍体模型，设置G0/G1峰位置，拟合范围覆盖整个峰形。
    • 软件会自动拟合G0/G1峰、S期分布和G2/M峰，并计算各时相的细胞百分比（G0/G1%, S%, G2/M%）。
  4. 记录结果：
    • 各时相细胞百分比。
    • 拟合优度指标（如Chi^2值，RCS值），评估拟合质量（通常Chi^2 < 3, RCS < 5%视为较好）。
    • G0/G1峰的变异系数（Coefficient of Variation, CV），反映染色质量和仪器状态（CV值通常应<8%，理想<5%）。
  5. （可选）细胞倍性分析：若有已知DNA含量的参照细胞（如鸡红细胞、鳟鱼红细胞），可同步处理上样，通过比较主峰位置判断待测细胞群的DNA倍性是否异常。
 

五、 关键注意事项与优化

  1. 单细胞悬液： 制备和固定过程中务必获得良好的单细胞悬液，避免细胞聚集。涡旋、吹打力度需轻柔。过滤是上机前去除聚集体的关键步骤。
  2. 固定： 乙醇必须预冷（-20℃）。加入乙醇时要缓慢、轻柔涡旋。固定时间不足或过长都可能影响染色结果和峰形。固定后细胞沉淀要去除干净乙醇。
  3. RNase处理： RNase的浓度和消化时间至关重要。浓度不足或时间过短会导致PI与RNA结合，造成G0/G1峰拖尾、CV值增大，甚至出现假峰（介于G0/G1和G2/M之间）。建议使用商品化的无DNase污染的RNase A。
  4. PI浓度与避光： PI具有光敏性，操作全程需避光（如使用铝箔包裹试管）。PI浓度过高会增加背景和非特异性染色，过低则信号弱。需根据细胞类型优化。
  5. 染色缓冲液组成： Triton X-100或柠檬酸钠可增加膜通透性，帮助PI进入核内。但其浓度和必要性需根据细胞类型测试（有些细胞在PI/RNase/PBS中通透性已足够）。
  6. 样品新鲜度： 固定过久的样品（数周以上）染色效果可能变差、CV值增大。染色后样品应尽快检测。
  7. 流式检测： 确保仪器状态良好（激光稳定，液流稳定，光学系统洁净）。每次实验最好能运行相同固定/染色条件的对照样品以验证重现性。PI通道的电压设置需使G0/G1峰在坐标轴中间偏左位置（对数坐标），避免信号饱和或过低。
  8. 数据分析： 圈门排除碎片和粘连细胞是准确分析的基础。选择合适的拟合模型（二倍体是最常用的）。仔细检查拟合曲线与实际数据点的吻合度（Chi^2值或RCS值）和G0/G1峰的CV值。S期的计算对模型和噪音水平较敏感。
  9. 细胞状态： 确保待测细胞处于良好的生长状态。避免处理过程中细胞死亡率过高（死细胞DNA降解会导致sub-G1峰出现）。
  10. 阴性对照： 条件允许时，设置仅含PI/RNase缓冲液（无细胞）或不加PI的细胞样品作为对照，有助于设定荧光补偿和阈值（虽非常规必需）。
 

六、 实验结果解读与应用

  • 细胞增殖活性评估： S期百分比增高通常表明细胞增殖活跃（如药物刺激后、肿瘤细胞）；G0/G1期百分比增高可能反映细胞处于静止状态（如接触抑制、血清饥饿、药物导致的G1期阻滞）。
  • 细胞周期阻滞研究： 是研究抗癌药物、生长因子、基因调控（如过表达/敲除细胞周期蛋白或激酶/磷酸酶）作用机制的核心手段。通过比较处理组与对照组各时相比例的变化，可判断药物/基因作用是阻滞在G1期、S期还是G2/M期。
  • 细胞倍性分析： 辅助判断细胞是否存在非整倍体（aneuploidy）或多倍体（polyploidy）。
  • 细胞凋亡辅助判断： 细胞周期直方图中G0/G1峰前的峰（sub-G1峰）通常代表DNA发生片段化的凋亡细胞。但需结合其他凋亡检测方法（如Annexin V/PI双染）确认。
 

通过严格遵循本实验方案，注意关键操作细节（尤其是单细胞悬液制备、固定、RNase消化和避光），并结合严谨的数据分析（圈门、拟合模型选择、CV值和拟合优度评估），即可获得可靠的细胞周期分布数据，为细胞增殖与周期调控研究提供重要依据。

参考文献：

  1. Darzynkiewicz, Z., Crissman, H., & Jacobberger, J. W. (2004). Cytometry of the cell cycle: Cycling through history. Cytometry Part A, 58(1), 21-32.
  2. Ormerod, M. G. (Ed.). (2000). Flow Cytometry: A Practical Approach (3rd ed.). Oxford University Press. (See Chapter on Cell Cycle Analysis).
  3. Shapiro, H. M. (2003). Practical Flow Cytometry (4th ed.). Wiley-Liss. (See Chapter 9: Cellular DNA Content Analysis).
  4. Vindeløv, L. L., Christensen, I. J., & Nissen, N. I. (1983). A detergent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis. Cytometry, 3(5), 323-327. (Classic protocol).
  5. Krishan, A. (1975). Rapid flow cytofluorometric analysis of mammalian cell cycle by propidium iodide staining. The Journal of Cell Biology, 66(1), 188-193. (Seminal paper on PI staining for cell cycle).
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