细胞成肝诱导实验

发布时间：2026-04-16 阅读量：10 作者：生物检测中心

细胞成肝诱导实验技术方案

摘要：
本方案描述了利用多能干细胞（如胚胎干细胞或诱导多能干细胞）在体外定向分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的系统方法。该方案基于生长因子和信号通路调控的阶段性诱导策略，旨在获取表达肝脏特异性标记物并具备关键代谢功能的细胞群体，为肝脏疾病建模、药物筛选及再生医学研究提供细胞来源。

一、引言
体外获得功能性肝细胞对于基础研究与临床应用至关重要。原代肝细胞体外扩增困难且功能易丧失，而多能干细胞具有无限增殖和分化为三胚层细胞的潜能。通过模拟胚胎肝脏发育的微环境与信号通路，可在体外将多能干细胞高效诱导为肝细胞样细胞。

二、材料与试剂

  • 细胞来源： 人多能干细胞（hPSCs），状态良好，无分化迹象。
  • 培养基：
    • 基础培养基 (Basal Medium)： DMEM/F12 + GlutaMAX™ (或等效品)
    • hPSC 维持培养基： 基础培养基 + 20% KSR (KnockOut™ Serum Replacement) + 非必需氨基酸 + β-巯基乙醇 + bFGF (10-20 ng/ml)。注：使用无饲养层培养系统更佳。
    • 内胚层诱导培养基 (Endoderm Induction)： 基础培养基 + 0.5-2%胎牛血清 + 100 ng/ml Activin A + 25-50 ng/ml WNT3a + 0.5-1 mM 丁酸钠 (Days 1-3)。
    • 肝母/肝细胞前体诱导培养基 (Hepatic Specification)： 基础培养基 + 1-2% B27补充剂 + 20-50 ng/ml BMP4 + 30-50 ng/ml FGF2/bFGF + 20 ng/ml HGF (Days 4-7)。
    • 肝细胞成熟培养基 (Hepatocyte Maturation)： 基础培养基 + 1-2% B27补充剂 + 20 ng/ml HGF + 10-20 ng/ml Oncostatin M (OSM) + 0.1 µM 地塞米松 + 1% ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) + 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) (Days 8-21+)。可酌情添加尼克酰胺 (10 mM)。
  • 关键生长因子： 重组人 Activin A, 重组人 WNT3a, 重组人 BMP4, 重组人 FGF2/bFGF, 重组人 HGF, 重组人 Oncostatin M (OSM)。
  • 小分子化合物： 丁酸钠 (Sodium Butyrate)， 地塞米松 (Dexamethasone)。
  • 基质胶: 基底膜基质提取物（如源自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤的凝胶），用于包被培养皿。
  • 耗材： 组织培养瓶/皿（常用6孔板），无菌移液管、枪头，离心管等。
  • 细胞解离试剂： 含EDTA的酶解离液或温和的细胞解离试剂。
  • 磷酸盐缓冲液（PBS）。
 

三、实验方法
前期准备：

  1. 基质胶包被： 将基底膜基质提取物用预冷的DMEM/F12或无血清培养基按推荐比例（通常在1:100至1:30之间）稀释，均匀覆盖培养皿底部（如6孔板每孔加1-1.5ml），置37°C培养箱中至少1小时（或按说明书过夜）。使用前吸弃多余液体，勿让孔底干燥。
  2. hPSC准备： 将状态良好的hPSC（建议80-90%汇合度）用温和解离试剂消化成小细胞团块（非单细胞）。离心收集细胞团，用hPSC维持培养基重悬，接种于基质胶包被的孔板中。待细胞贴壁恢复良好形态（通常24-48小时）且达到合适汇合度（约70-80%）后开始诱导。
 

阶段一：拟定型内胚层诱导 (Days 1-3)

  1. Day 0 (诱导起始)： 吸弃hPSC维持培养基。轻柔PBS洗涤细胞一次。
  2. 加入预温的内胚层诱导培养基（例如：含1%胎牛血清，100 ng/ml Activin A， 50 ng/ml WNT3a， 1mM丁酸钠的基础培养基）。
  3. 将细胞放入37°C, 5% CO₂培养箱中培养。
  4. Day 1 & Day 2： 每天更换新鲜的内胚层诱导培养基。
  5. Day 3： 更换新鲜的内胚层诱导培养基（此日可考虑降低血清浓度或省略），继续培养24小时。此阶段结束时，细胞形态应变扁长、呈鹅卵石样排列（上皮样），汇合度显著增加。应高比例表达内胚层标志物SOX17、FOXA2（通过免疫荧光染色或流式细胞术验证）。
 

阶段二：肝向特化 (Days 4-7)

  1. Day 4： 吸弃旧培养基，PBS轻柔洗涤一次。
  2. 加入预温的肝母/肝细胞前体诱导培养基（基础培养基 + 1% B27 + 30 ng/ml BMP4 + 30 ng/ml FGF2/bFGF + 20 ng/ml HGF）。
  3. 放入培养箱培养。
  4. Days 5-7： 每天更换新鲜的肝向特化培养基。
  5. 此阶段结束时，细胞形态趋向多角形，聚集倾向增加。应表达肝母/前体细胞标志物如AFP、HNF4α、TBX3（免疫荧光染色验证）。
 

阶段三：肝细胞成熟 (Days 8-21+)

  1. Day 8： 吸弃旧培养基，PBS轻柔洗涤一次。
  2. 加入预温的肝细胞成熟培养基（基础培养基 + 1% B27 + 20 ng/ml HGF + 20 ng/ml OSM + 0.1 µM 地塞米松 + 1% ITS + 0.1% BSA）。注意：此培养基配方可优化，如添加尼克酰胺等。
  3. 放入培养箱培养。
  4. 后续换液： 每两天更换一次新鲜的肝细胞成熟培养基（OSM和地塞米松是关键）。此阶段持续时间较长，通常需要10-30天以达到较成熟状态。期间细胞形态逐渐变为典型多边形肝细胞外观，形成岛状或片状结构。
  5. （可选）提高功能性：
    • 3D培养： 在诱导后期（如Day 14后），可尝试将细胞消化成单细胞或小团块，接种至超低吸附板进行悬滴或旋转悬浮培养形成类器官（需在成熟培养基中添加特定成分如R-spondin1、EGF等），或在生物反应器中培养，模拟3D微环境。
    • 共培养： 与内皮细胞、间充质干细胞等进行共培养可改善成熟度。
 

四、分化效率与功能评估
诱导结束后需严格评估所得HLCs的质量：

  1. 形态学观察： 倒置显微镜下观察细胞形态（多边形、双核、清晰细胞边界等）。
  2. 免疫细胞化学/荧光染色：
    • 早期/前体标志物： SOX17, FOXA2
    • 中期/前体标志物： AFP, HNF4α, TBX3
    • 成熟肝细胞标志物： 白蛋白 (ALB), 细胞角蛋白18 (CK18), 凝血因子相关抗原 (FVII/FIX), 肝细胞核因子1α/4α (HNF1α/4α), 细胞色素P450酶 (CYP3A4, CYP1A2等), 多药耐药相关蛋白2 (MRP2), 胆盐输出泵 (BSEP)。
  3. RT-qPCR： 定量检测上述肝脏特异性基因的mRNA表达水平，与原代肝细胞比较。
  4. 功能检测 (关键)：
    • 白蛋白分泌： ELISA检测培养上清中ALB含量。
    • 尿素合成： 尿素检测试剂盒测定培养上清中尿素含量（通常需添加氯化铵刺激）。
    • 糖原储存： 过碘酸-雪夫 (PAS) 染色。
    • 吲哚菁绿 (ICG) 摄取与清除： 活细胞染色评估肝细胞摄取功能。
    • 细胞色素P450酶活性： 使用特异性底物（如CYP3A4的睾酮/咪达唑仑、CYP1A2的乙氧基试卤灵）孵育细胞，检测代谢产物生成速率（常用液相色谱-质谱LC-MS或荧光法）。
    • 低密度脂蛋白 (LDL) 摄取： DiI标记的LDL孵育后检测细胞荧光强度。
    • 胆汁酸转运： 可通过检测荧光标记胆汁酸类似物（如CDFDA）的摄取和外排来评估。
 

五、关键注意事项与优化

  1. 细胞状态： 起始hPSCs的状态是成败的关键。 必须使用未分化、核型正常、无支原体污染的高质量细胞。
  2. 汇合度控制： 诱导起始时细胞汇合度过低易导致分化效率低下，过高则易自发分化或死亡。
  3. 生长因子活性与浓度： 不同批次或来源的生长因子活性可能有差异，需预实验优化浓度。严格按照说明书溶解和保存，避免反复冻融。
  4. 培养基更换与操作轻柔： 换液动作需轻柔，避免损伤形成的上皮层。确保培养基新鲜并充分预热。
  5. 基质胶批次： 不同批次基质胶的成分和成胶能力有差异，建议使用同一批次完成一个完整实验。
  6. 分化效率不均： 分化过程中常出现异质性。可通过流式分选（如基于AFP、ALB表达）或差异贴壁法富集目标细胞。
  7. 成熟度不足： HLCs通常在功能上（尤其CYP450活性）低于原代肝细胞。优化成熟阶段配方（如添加FGF19、Notch抑制剂等）、延长培养时间、采用3D培养或共培养策略可改善。
  8. 无菌操作： 整个实验过程严格遵守无菌操作规范，防止污染。
 

六、应用前景
体外诱导生成的HLCs在多个领域具有重要价值：

  1. 肝脏疾病模型： 利用患者来源的iPSCs诱导HLCs，构建遗传性肝病（如α1-抗胰蛋白酶缺乏症、Wilson病）或获得性肝病（如脂肪肝、病毒性肝炎）模型，研究发病机制。
  2. 药物肝毒性筛选与代谢研究： 高通量评估候选药物对肝细胞的直接毒性、代谢谱预测及药物-药物相互作用，比传统肝细胞系更具生理相关性。
  3. 生物人工肝支持系统： 作为生物反应器中的功能性细胞成分，提供短期肝功能支持。
  4. 肝细胞移植研究： 探索HLCs移植治疗终末期肝病的可行性（需解决细胞数量、成熟度、体内长期存活与功能整合、安全性等问题）。
 

结论：
本方案提供了一个基于生长因子阶段性诱导hPSCs向肝细胞样细胞分化的标准化流程。虽然所得HLCs在功能上尚未完全等同于原代肝细胞，但通过不断优化培养条件和评估体系，其成熟度和功能性正不断提升。该技术为肝脏生物学研究、药物开发和潜在的再生医学应用提供了强大的细胞工具平台。持续的研究将聚焦于克服成熟度瓶颈、提高规模化生产效率和探索体内移植治疗的可行性。

（本方案基于公开文献报道的通用方法学原理构建，旨在提供技术参考。）

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