SDS-PAGE电泳纯度：原理、应用与判读指南
SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是评估蛋白质样品纯度的核心、快速且直观的技术手段，尤其在生物化学、分子生物学和蛋白质工程领域应用广泛。其检测的“纯度”主要反映蛋白质分子大小均一性及是否存在杂质蛋白或聚集物。
一、 基本原理
- 变性与负电荷加载： 蛋白质样品在含有强阴离子去污剂SDS和还原剂（如β-巯基乙醇或DTT）的缓冲液中加热变性。SDS以约1.4克SDS/1克蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链上，使蛋白质带均一的负电荷；还原剂则断裂二硫键，使蛋白质完全解聚成单条多肽链。
- 分子筛分离： 变性的、带大量负电荷的多肽链在聚丙烯酰胺凝胶形成的网状结构中迁移。凝胶浓度决定了孔径大小。小分子多肽迁移快，大分子多肽迁移慢。蛋白质的迁移率主要取决于其分子量，基本不受其原始电荷和形状影响。
- 染色与显影： 电泳结束后，使用考马斯亮蓝、银染或荧光染料对凝胶中的蛋白质进行染色，使蛋白质条带可视化。
二、 评估纯度的核心判读标准
- 主条带单一性： 对于理想的纯化样品，在预期的分子量位置应观察到单一、清晰、尖锐的主条带。这是高纯度最重要的直观指标。
- 杂质条带的缺失或极低丰度：
- 高分子量区域 (>目标分子量)： 条带可能指示未解聚的蛋白质寡聚体、多聚体或蛋白质聚集物。
- 低分子量区域 (<目标分子量)： 条带可能指示：
- 蛋白质降解产物（如蛋白酶水解片段）。
- 不完全翻译产物。
- 样品制备过程中引入的杂质蛋白。
- 其他位置条带： 出现在任意位置的非预期条带通常视为杂质蛋白或非目标蛋白产物。
- 条带清晰度与拖尾： 清晰的条带边缘表明样品在凝胶中迁移均一。主条带下方出现“拖尾”（Smearing）现象常提示样品存在部分降解、不完全变性或修饰不均一（如糖基化程度不同）。
三、 SDS-PAGE纯度分析的关键步骤
- 样品制备： 样品需在含SDS和还原剂的缓冲液中充分变性（通常95-100°C加热5-10分钟），确保完全解聚和电荷均一化。
- 凝胶选择： 根据目标蛋白分子量范围选择合适的凝胶浓度（如12%-15%分离胶）。梯度胶可分离较宽分子量范围的混合物。
- 电泳条件： 优化电压/电流和电泳时间，确保目标蛋白在胶内充分分离且条带锐利。常用恒压电泳。
- 染色方法：
- 考马斯亮蓝染色： 最常用，操作简便，成本低。检测限约0.1-1 μg/条带。
- 银染： 灵敏度极高（可达ng级），能检测痕量杂质，但操作复杂，线性动态范围窄。
- 荧光染色： 灵敏度介于考染和银染之间（低ng级），定量性好，兼容下游质谱分析。
- 成像与分析： 使用凝胶成像系统捕获图像。可通过专业软件对条带进行半定量分析（如计算主条带占泳道总蛋白的百分比），但这主要用于初步估算，并非绝对定量。
四、 SDS-PAGE纯度检测的优势
- 操作相对简便快捷。
- 成本较低。
- 结果直观可视，可直接观察是否存在杂质条带及降解情况。
- 可同时提供目标蛋白分子量信息（需与分子量标准品比对）。
- 样品消耗量较少。
五、 重要局限性与注意事项
- 非绝对定量： 条带强度反映蛋白质含量，但不同蛋白质对染料的结合能力（如考马斯亮蓝）可能不同，影响量化准确性。主要用于定性或半定量纯度评估。
- 无法区分分子量相近的杂质： 若杂质蛋白与目标蛋白分子量极其接近，可能无法在凝胶上有效分离，表现为单一增宽条带或重叠条带。降低凝胶浓度或使用梯度胶可能改善分离。
- 无法检测非蛋白杂质： SDS-PAGE只能检测蛋白质或多肽类杂质。核酸、脂质、糖类（除非糖蛋白）、盐离子、小分子化合物等非蛋白污染物无法通过此方法检出。
- 对电荷/翻译后修饰不敏感： 由于SDS掩盖了蛋白质自身的电荷，也无法区分仅因电荷不同（如不同磷酸化状态）或某些翻译后修饰（如糖基化，仅当引起分子量显著变化时可见）导致的蛋白亚型。
- 无法验证生物学活性： 纯度不等于活性。SDS-PAGE检测的是物理化学纯度（分子大小均一性），不能反映蛋白质是否具有正确的折叠构象和生物功能。
- 凝胶制作品质： 自制凝胶的批次间差异可能影响分离效果和重复性。使用商业化预制胶可提高一致性和便利性。
- 上样量影响： 上样量过大可能导致条带过载、变形（笑脸状）或掩盖邻近弱条带。应优化上样量以获得清晰分离。
六、 结论
SDS-PAGE是评估蛋白质样品纯度的基石技术，以其直观、快速和经济的特点，广泛应用于蛋白质纯化流程监控、最终产品质量控制和实验样品筛查。其核心价值在于检测分子量大小的不均一性（如聚集、降解）。然而，必须清晰认识到其局限性：它提供的是基于分子量的相对纯度信息，而非绝对定量，且无法检测非蛋白杂质或分子量相近的蛋白杂质。
因此，全面的蛋白质纯度表征通常需要多种互补技术的支持：
- 检测电荷异质性：等电聚焦电泳 (IEF)、毛细管等电聚焦 (cIEF)、离子交换色谱 (IEX-HPLC)。
- 进行高灵敏度、高分辨率分离分析：反相高效液相色谱 (RP-HPLC)、尺寸排阻色谱 (SEC-HPLC)。
- 检测生物活性：细胞试验、酶活测定、结合实验等。
- 鉴定微量杂质或确认主成分：质谱 (MS) 。
将SDS-PAGE与其他分析方法结合使用，才能获得更全面、更可靠的蛋白质纯度评估结果。
总结框：SDS-PAGE纯度检测要点