酶联免疫吸附检测

发布时间：2026-04-16 阅读量：10 作者：生物检测中心

酶联免疫吸附检测 (ELISA)：原理、类型与应用

酶联免疫吸附检测 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 是一种高度灵敏且特异的生物化学分析技术，广泛应用于医学诊断、生物研究、食品安全和环境监测等领域。其核心原理是利用抗原-抗体间的特异性结合反应，并通过酶促反应对结合事件进行放大和可视化（或可检测化），从而实现对目标分子（抗原或抗体）的定性和定量分析。

核心原理

ELISA 的基础建立在免疫学的抗原-抗体特异性结合之上。其关键步骤在于将抗原或抗体预先固定（吸附）在固相载体表面（通常是微孔板的孔底）。随后加入待测样本（可能含有目标抗原或抗体）和相应的酶标记物（酶标抗体或酶标抗原）。如果待测样本中存在目标分子，它们会与固相上的捕获分子发生特异性结合。洗去未结合的物质后，加入酶的特异性底物。酶催化底物发生反应，产生可测量的信号（如显色、荧光或化学发光）。信号的强度与固相载体上结合的待测目标分子的量成正比。

主要类型与方法

根据实验设计和检测目标的不同，ELISA 主要有以下几种基本类型：

  1. 直接 ELISA:

    • 原理: 将待测抗原直接吸附在固相载体上，然后加入酶标记的特异性一抗与之结合。
    • 特点: 操作步骤简单、快速。但每个待测抗原都需要特定的酶标一抗，灵活性较低；信号放大作用有限，灵敏度通常低于间接法。
    • 适用: 常用于检测高丰度抗原或需要快速筛查的情况。

  2. 间接 ELISA:

    • 原理: 将待测抗原吸附在固相载体上，加入未标记的特异性一抗与之结合，洗去未结合的一抗后，再加入酶标记的二抗（抗一抗的抗体）。酶标二抗与结合在抗原上的一抗结合。
    • 特点: 具有显著的信号放大效应（一个一抗可结合多个二抗），灵敏度高；使用通用的酶标二抗（如抗小鼠、抗兔IgG），节省成本并提高灵活性（只需更换特异性一抗即可检测不同抗原）。
    • 适用: 最常用类型，特别适用于检测血清、体液等样本中的特异性抗体（如病原体抗体、自身抗体检测）。

  3. 夹心 ELISA (Sandwich ELISA):

    • 原理: 使用两种针对同一抗原不同表位的抗体。一种抗体作为“捕获抗体”预先包被在固相载体上，用于捕获溶液中的待测抗原。洗去未结合物后，加入另一种“检测抗体”（酶标记或未标记）与抗原的另一表位结合。若检测抗体未标记，则需再加入酶标二抗（类似于间接法）。
    • 特点: 特异性非常高（需两个抗体同时结合）；灵敏度高（双抗体识别）；适用于检测复杂混合物中的抗原，且抗原无需预先纯化；通常要求待测抗原是多价抗原（具有至少两个不同表位）。
    • 适用: 检测复杂样本（如血清、细胞裂解液、组织匀浆）中的蛋白质、激素、细胞因子等可溶性抗原。是检测抗原最常用的ELISA类型。

  4. 竞争 ELISA (Inhibition ELISA):

    • 原理: 将已知量的抗原（或抗体）预先包被在固相上。同时加入待测样本（含未知浓度的目标抗原）和固定量的酶标记抗原（或抗体）。待测样本中的目标抗原与酶标抗原竞争结合固相上有限的抗体结合位点（或待测抗体与包被抗原竞争结合酶标抗体）。洗去未结合物后，加入底物显色。待测样本中目标物浓度越高，竞争越激烈，导致最终结合的酶标物越少，产生的信号越弱（即信号强度与目标物浓度成反比）。
    • 特点: 特别适用于检测小分子抗原（半抗原，通常只有一个表位，无法用于夹心法）；或检测只具有单一表位的大分子；或样本基质非常复杂的情况；对样本纯度要求相对较低。
    • 适用: 检测小分子药物、激素、毒素（如黄曲霉毒素）、农药残留等。
 

基本操作流程 (以间接法检测抗体为例)

  1. 包被 (Coating): 将已知抗原溶于合适的包被缓冲液（通常为碳酸盐缓冲液，pH 9.6）中，加入微孔板各孔，孵育（通常4°C过夜或37°C 1-2小时），使抗原吸附在孔底。
  2. 封闭 (Blocking): 洗去未结合的抗原后，加入封闭液（常用含牛血清白蛋白BSA或脱脂奶粉的缓冲液），孵育（通常37°C 1-2小时）。封闭液中的蛋白质占据孔板上未被抗原占据的位点，减少后续步骤中非特异性结合造成的背景。
  3. 加样与一抗孵育 (Sample & Primary Antibody Incubation): 洗去封闭液，加入稀释的待测样本（如血清）和/或对照（阳性对照、阴性对照、空白对照）。孵育（通常37°C 1小时或室温更长），使样本中的特异性抗体（一抗）与固相抗原结合。
  4. 洗涤 (Washing): 彻底洗去未结合的物质（样本、游离抗体等）。
  5. 加酶标二抗孵育 (Enzyme-Conjugated Secondary Antibody Incubation): 加入稀释好的酶标二抗（如辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP标记的抗人IgG抗体）。孵育（通常37°C 1小时），使二抗与结合在抗原上的一抗结合。
  6. 洗涤 (Washing): 再次彻底洗涤，去除未结合的酶标二抗。
  7. 加底物显色 (Substrate Addition & Color Development): 加入酶对应的底物溶液。酶催化底物反应，产生有色产物（或荧光/化学发光）。在特定时间（通常室温避光孵育10-30分钟）内，反应发生。
  8. 终止反应与读数 (Stop Reaction & Reading): 加入终止液（如HRP常用硫酸，ALP常用EDTA或NaOH）终止酶促反应。立即使用酶标仪在特定波长下读取各孔的吸光度值（OD值）。
 

结果判读与定量

  • 定性: 通常将待测样本的OD值与设定的临界值（Cut-off value，常由阴性对照平均值乘以系数确定）比较。样本OD值 ≥ 临界值判为阳性；< 临界值判为阴性。
  • 半定量: 将样本OD值与同时检测的标准品（系列浓度梯度的阳性对照）绘制的标准曲线进行比较，计算出样本中目标物的相对浓度。
 

质量控制要点

  • 设立对照: 每次实验必须包含：
    • 阳性对照 (Positive Control): 已知含有目标物的样本，验证实验系统有效。
    • 阴性对照 (Negative Control): 已知不含目标物的样本（如空白缓冲液或健康个体样本），确定检测特异性并帮助设定临界值。
    • 空白对照 (Blank Control): 仅含底物和终止液（有时包含无酶二抗的步骤），用于扣除背景。
    • 标准曲线 (Standard Curve): 用于定量分析。
  • 重复: 重要样本和对照通常做复孔或三孔检测，取平均值，提高结果可靠性。
  • 洗涤: 充分的洗涤是降低背景和非特异性结合的关键。
  • 试剂: 使用合格的试剂，注意有效期和保存条件。
 

优势

  • 高灵敏度: 可检测皮克(10^-12 g)甚至飞克(10^-15 g)级别的物质。
  • 高特异性: 基于抗原-抗体的精确识别。
  • 高通量: 微孔板形式便于同时处理大量样本。
  • 操作相对简便: 步骤标准化，易于自动化。
  • 结果客观: 可通过仪器读取数据。
  • 应用范围广: 适用于多种生物样本和目标分子。
 

局限性

  • 需要特异性抗体: 抗体的质量和特异性是实验成功的关键。
  • 可能存在的交叉反应: 抗体可能与结构相似的分子发生非预期结合。
  • 钩状效应 (Hook Effect): 在夹心ELISA中，当抗原浓度极高时，可能因竞争导致信号反而下降，造成假阴性（需对高浓度样本进行稀释复测）。
  • 背景干扰: 样本中的杂质、非特异性结合等可能导致背景升高。
  • 试剂成本: 特别是高质量的抗体和酶标记物成本可能较高。
  • 时间: 整个流程通常需要数小时至过夜。
 

应用领域

  • 临床诊断: 传染病诊断（HIV、乙肝、丙肝、梅毒、新冠抗体/抗原等）、激素检测（HCG、FSH、TSH等）、肿瘤标志物筛查（AFP、CEA、PSA等）、自身免疫病诊断（抗核抗体、类风湿因子等）、过敏原检测。
  • 生物医学研究: 蛋白质表达水平分析、信号通路研究、蛋白质相互作用、抗体筛选与鉴定、疫苗评价。
  • 食品安全: 检测病原微生物（沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7等）、毒素（黄曲霉毒素、呕吐毒素等）、农药残留、兽药残留、转基因成分、过敏原（花生、麸质等）。
  • 药物研发: 药代动力学研究（检测血药浓度）、抗药抗体检测、生物标志物分析。
  • 法医学: 体液鉴定、药物滥用检测。
  • 环境监测: 检测水或土壤中的污染物（如重金属、有机污染物、病原体）。
 

总结

酶联免疫吸附检测（ELISA）凭借其灵敏度高、特异性强、操作相对标准化、通量高以及应用范围极其广泛的特点，已成为现代生命科学研究和医学诊断不可或缺的基石技术。理解其基本原理、熟悉不同类型ELISA的适用场景、掌握规范的操作流程并严格进行质量控制，是获得可靠、准确实验结果的关键。随着技术的不断发展（如化学发光ELISA、数字ELISA的出现），其检测性能和适用范围仍在持续提升和拓展。

参考文献 (示例格式)：

  1. Engvall, E., & Perlmann, P. (1971). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8(9), 871–874.
  2. Crowther, J. R. (2009). The ELISA Guidebook. Humana Press.
  3. Lequin, R. M. (2005). Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry, 51(12), 2415–2418.
  4. Wild, D. (Ed.). (2013). The Immunoassay Handbook: Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques (4th ed.). Elsevier. (注意：此为经典参考书，实际引用章节需具体)
底部图片-PC版 底部图片-移动版