ATP硫化酶活性检测

发布时间：2026-04-16 阅读量：47 作者：生物检测中心

ATP硫化酶活性检测方法

摘要：
本方法基于ATP硫化酶（ATP sulfurylase）催化ATP与亚硫酸盐（SO₃²⁻）生成腺苷-5′-磷酰硫酸（APS）和无机焦磷酸（PPi）的反应。通过定量测定反应产物APS的量来确定酶活性水平。本方法具有灵敏度高、特异性好、操作相对简便的特点。

一、 检测原理
ATP硫化酶催化以下反应：

 
 
 
ATP + SO₃²⁻ → APS + PPi

在该反应体系中加入过量的亚硫酸钠（提供SO₃²⁻）和ATP作为底物。反应启动后，在特定时间点加入强酸终止反应并沉淀蛋白。离心去除沉淀后，上清液中含有的APS在钼酸铵存在的条件下，可被还原剂（如抗坏血酸）还原，生成蓝色的磷钼蓝络合物。该蓝色物质在660 nm波长处具有特征吸收峰。通过测定660 nm处的吸光度值（OD660），并与已知浓度的APS标准曲线进行比较，即可计算出反应生成的APS量，从而计算出酶活性。

二、 所需试剂与仪器

  • 试剂：

    1. 反应缓冲液 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0): 称取适量Tris碱溶于约80 mL去离子水中，用HCl调节pH至8.0，定容至100 mL。
    2. ATP溶液 (20 mM): 准确称取ATP二钠盐（分子量按551.14计算），用反应缓冲液溶解并定容。分装后于-20℃冻存备用（避免反复冻融）。
    3. 亚硫酸钠溶液 (Na₂SO₃, 100 mM): 准确称取亚硫酸钠（分子量126.04），用去离子水溶解并定容（现用现配）。
    4. 酶样品溶液： 待测酶液（组织匀浆上清、细胞裂解液或纯化酶液），用反应缓冲液适当稀释至活性测定范围内。需设置不含酶（以缓冲液代替）的空白对照。
    5. 终止液 (10% TCA, 4 mM Na₂EDTA): 称取10 g三氯乙酸（TCA）和0.149 g EDTA二钠盐（Na₂EDTA·2H₂O, 分子量372.24），溶于约80 mL去离子水中，溶解后用去离子水定容至100 mL。4℃保存。
    6. APS标准溶液 (1 mM): 准确称取APS（腺苷-5′-磷酰硫酸，三锂盐或三环己铵盐，分子量按对应盐形式计算），用去离子水溶解定容。分装后于-20℃冻存。临用前稀释系列浓度（如0, 5, 10, 20, 30, 40, 50 μM）用于制作标准曲线。
    7. 显色液：
      • 溶液A (0.42% 钼酸铵 in 1 N H₂SO₄): 称取0.42 g钼酸铵 ((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O) 溶于约70 mL去离子水中。缓缓加入2.8 mL浓硫酸（98%），混匀。冷却至室温后，用去离子水定容至100 mL。
      • 溶液B (10% 抗坏血酸): 称取1.0 g抗坏血酸溶于10 mL去离子水中（现用现配）。
      • 工作显色液: 将溶液A和溶液B按1:1体积比混合（现用现配）。

  • 仪器：

    1. 恒温水浴锅（温度精度±0.5℃）
    2. 冷冻离心机
    3. 分光光度计 (配备可见光检测器)
    4. 微量移液器 (10 μL, 100 μL, 1000 μL)
    5. 计时器
    6. 离心管 (1.5 mL)
    7. 比色杯 (光程1 cm)
    8. 涡旋混合器
 

三、 实验步骤

  1. 反应体系配制 (冰上进行)： 在预冷的1.5 mL离心管中，依次加入以下试剂：

    • 反应缓冲液： 补足至最终反应体积所需量（如最终体积200 μL，则加入缓冲液体积 = 200 - ATP体积 - Na₂SO₃体积 - 酶体积）
    • 20 mM ATP溶液： 20 μL (终浓度 2 mM)
    • 100 mM Na₂SO₃溶液： 20 μL (终浓度 10 mM)
    • 去离子水： 补充体积至终体积差（例如140 μL）
      轻微涡旋混匀。

  2. 启动反应与孵育： 将离心管置于预热至设定温度（通常为37℃）的恒温水浴锅中平衡约2分钟。准确加入适当体积（通常10-50 μL，体积计入总反应体积）的酶样品溶液（或空白对照缓冲液），立即启动计时器，轻柔涡旋混匀。准确孵育设定的时间（如10-30分钟）。

  3. 终止反应： 到达预定孵育时间后，立即加入200 μL预冷的终止液 (10% TCA/4 mM EDTA)，迅速涡旋混匀（剧烈振荡）以充分终止酶反应并使蛋白质变性沉淀。

  4. 沉淀去除： 将离心管置于冰上放置5-10分钟。然后在4℃下，以≥12000 g (约13000 rpm)离心10分钟，使变性蛋白沉淀完全。

  5. APS显色测定： 小心吸取200 μL上清液（避免吸入沉淀），转移至一个新的洁净离心管（或比色杯）中。加入1.0 mL工作显色液（钼酸铵/抗坏血酸混合液），立即涡旋混匀。

  6. 显色孵育： 将混合物置于37℃水浴中孵育20分钟（或室温避光放置30分钟），使蓝色充分显色。

  7. 吸光度测定： 将反应液转移至1 cm光程的比色杯中，使用分光光度计在660 nm波长处测定吸光度（OD660）。用APS标准曲线管和空白对照管（不含酶样品）同步测定。

  8. 标准曲线制作： 取不同浓度（如0, 5, 10, 20, 30, 40, 50 μM）的APS标准溶液200 μL，同样加入200 μL终止液，混匀后取200 μL上清液（此步可省略离心，因无蛋白沉淀），加入1.0 mL工作显色液，同步骤6和7进行显色和测定OD660。以APS浓度为横坐标，OD660为纵坐标绘制标准曲线（应为良好线性）。

 

四、 结果计算

  1. APS生成量计算：

    • 根据测得的样品OD660值，从APS标准曲线上查得对应的APS浓度（μM）。
    • 计算反应体系中生成的APS摩尔数：
      生成的APS (nmol) = (查得的APS浓度 (μM)) * (反应液终止后用于显色的上清液体积 (L)) * 1000
      • 示例：若标准曲线上查得浓度为25 μM，用于显色的上清体积为200 μL (0.0002 L)，则生成的APS = 25 μM * 0.0002 L * 1000 = 5 nmol。
      • 注意：显色时取的是终止后反应混合物的上清液200 μL。终止后总体积是反应体积(200 μL) + 终止液体积(200 μL) = 400 μL。因此，这200 μL上清液代表原始反应混合物的200 μL / 400 μL = 50%。计算时已考虑了此稀释因子。如果显色时取的是不同体积的上清液，需相应调整稀释因子。

  2. 酶活性计算：

    • 酶活性单位（U）定义为：在特定反应条件下（温度、pH），每分钟催化生成1 μmol APS所需的酶量。
    • 计算公式：
      酶活性 (U/mL) = [生成的APS (nmol) / 反应时间 (min)] * [1000 / 1000] * [稀释倍数 / 加入的酶体积 (mL)]
      • 生成的APS (nmol) / 反应时间 (min)：得到每分钟生成APS的nmol数。
      • (nmol/min) * (1000 / 1000) = (nmol/min) * 1 = nmol/min （因为1 μmol = 1000 nmol，所以(nmol/min) * (1 μmol / 1000 nmol) = μmol/min * 0.001，此处除以1000转化为μmol/min更直观，但计算时可简化：(生成的APS (nmol) / 反应时间 (min)) * (1 / 1000) 得到 μmol/min)。
      • 更清晰的写法：
        酶活性 (U/mL) = [ (生成的APS (nmol)) / (反应时间 (min)) ] * (1 μmol / 1000 nmol) * (1 / 加入的酶体积 (mL)) * 稀释倍数
        = [生成的APS (nmol) / 反应时间 (min)] * 0.001 * (稀释倍数 / 加入的酶体积 (mL))
      • 示例：孵育时间15分钟，生成的APS为5 nmol，加入的酶液体积为20 μL (0.02 mL)，酶液在检测前经过5倍稀释。
        酶活性 = [5 nmol / 15 min] * 0.001 * (5 / 0.02) = (0.333 nmol/min) * 0.001 * 250 = 0.08325 U/mL ≈ 0.083 U/mL
    • 对于纯化酶，常用比活力表示（U/mg蛋白）：
      比活力 (U/mg) = [酶活性 (U/mL)] / [蛋白浓度 (mg/mL)]
 

五、 注意事项

  1. 温度控制： 反应孵育和显色步骤的温度控制至关重要，需精确维持。
  2. 时间准确性： 反应启动和终止必须严格计时。
  3. 试剂新鲜度： 亚硫酸钠溶液、抗坏血酸溶液、工作显色液应现用现配。ATP标准液避免反复冻融。
  4. 混合充分： 加入酶启动反应、加入终止液终止反应以及加入显色液时，都必须迅速、充分混合均匀。
  5. 沉淀完全： 终止反应后需充分离心（≥12000 g，10分钟，4℃）以保证去除所有蛋白沉淀，避免干扰吸光度测定。
  6. 避免污染： 比色杯需保持清洁干燥，防止交叉污染。
  7. 酶量控制： 酶样品稀释度应使其在反应时间内生成的APS量落在标准曲线的线性范围内（通常在0-50 μM APS）。一般要求反应结束时OD660不超过1.0。
  8. 本底控制： 空白对照（不含酶）的OD660值应较低且稳定。若空白值过高，需检查试剂纯度（特别是ATP中APS杂质）或操作污染。
  9. 标准曲线： 每次实验必须同步制作标准曲线。
  10. 安全防护： 浓硫酸、三氯乙酸（TCA）具有腐蚀性和刺激性，配制和使用时需佩戴手套、护目镜，在通风橱内操作。
 

六、 方法特点与局限性

  • 优点： 原理清晰可靠，灵敏度较高（可检测nmol级别的APS），特异性较好，所需仪器为实验室常规设备。
  • 缺点： 属于终点法，需精确计时和终止反应。操作步骤相对较多（加样、孵育、终止、离心、取样、显色）。TCA终止法可能导致少量APS水解。反应底物ATP或产物PPi可能会对本底或显色有微弱干扰。
  • 替代方法： 可采用偶联连续监测法（如偶联焦磷酸酶和丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶系统，通过监测NADH在340 nm处的消耗速率间接反映ATP硫化酶活性），但该方法体系更复杂，成本更高。
 

通过严格遵守上述操作规程，本方法能够准确、可靠地测定ATP硫化酶的活性，适用于各种来源的样品（组织、细胞、纯化酶）分析。

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