Maldi-tof分子量

发布时间：2025-06-12 08:42:17 阅读量：3 作者：生物检测中心

MALDI-TOF 分子量测定原理及应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS) 作为一种强大的软电离质谱技术，因其高通量、高灵敏度、宽分子量范围测定能力及对复杂样品的高耐受性，已成为生物大分子（如蛋白质、多肽、核酸）和合成高分子精确分子量测定的核心工具。其核心在于测定离子在无场真空管中的飞行时间，该时间与其质荷比 (m/z) 的平方根成正比。

核心原理：

  1. 样品制备与共结晶：

    • 目标分析物（如蛋白、多肽、聚合物）溶解在适当的溶剂中。
    • 与大量过量的基质（小分子有机酸）溶液混合并点靶。
    • 溶剂挥发后，分析物分子均匀嵌入基质晶体中形成共结晶层。

  2. 激光解吸电离：

    • 脉冲激光（通常是紫外激光，如氮激光 337 nm）照射样品靶点。
    • 基质分子强烈吸收激光能量，导致局部晶体迅速升华和气化。
    • 在此剧烈的相变过程中，基质分子通过质子转移（正离子模式）或去质子化（负离子模式）等机制，将离子（通常是质子 H⁺）传递给包埋其中的分析物分子，使其带上电荷（通常为 +1 电荷）。
    • 此过程被称为“软电离”，能有效产生完整的分子离子（如 [M+H]⁺），显著减少碎片化，特别利于生物分子的测定。

  3. 离子加速与飞行时间分离：

    • 产生的离子在高电压（通常数千至数万伏特）作用下被瞬时加速，获得相同的初始动能：KE = 1/2 mv² = zVa（其中 m 为离子质量，v 为离子速度，z 为离子电荷数，Va 为加速电压）。
    • 离子随后进入一个处于真空状态、长度固定的无场漂移管。
    • 在漂移管中，离子仅依靠初始动能飞行。
    • 根据动能公式推导可得离子的飞行时间 t 与质荷比 (m/z) 的关系：t = L * √(m/z) / √(2Va) + C（其中 L 为漂移管长度，C 为常数项）。
    • 核心结论： 较轻的离子 (m/z 小) 飞行速度快，先到达检测器；较重的离子 (m/z 大) 飞行速度慢，后到达检测器。飞行时间 t 与 √(m/z) 成正比。

  4. 离子检测与谱图生成：

    • 离子飞出漂移管后，击中检测器（如微通道板检测器）。
    • 检测器将离子信号转换成电信号并放大。
    • 记录仪记录每个离子到达的时间信号（TOF），并将其强度对应记录下来。
    • 最终结果以质谱图形式呈现：横轴为m/z（根据已知标准品校准后由飞行时间换算得到），纵轴为离子信号相对强度。谱图中的主峰通常代表分析物的准分子离子峰（如 [M+H]⁺，[M+Na]⁺，[M-H]⁻ 等）。

MALDI-TOF 分子量测定的关键特点：

  • 宽质量范围： 理论上可覆盖从几百道尔顿（Da）到数百万道尔顿（Da），特别适合高分子量生物大分子或合成聚合物。
  • 高灵敏度： 通常仅需皮摩尔（pmol）甚至飞摩尔（fmol）级别的样品量。
  • 高通量： 样品靶可容纳成百上千个样品点位，自动化程度高，分析速度快。
  • 样品耐受性强： 对盐类、缓冲液、去垢剂等杂质有一定容忍度，简化前处理。
  • 主要产生单电荷离子： 峰图相对简单直观，分子量与测得 m/z 值 ([M+H]⁺ 或 [M-H]⁻) 接近（差一个质子质量），易于解读。但也会出现多电荷离子（尤其在分析超大分子时）。
  • 空间分辨率： 可进行组织切片等的成像分析（MALDI Imaging）。

分辨率与准确度提升技术：

  • 延迟引出： 在激光脉冲后推迟施加加速电压一段时间（纳秒级），允许初始能量分散的离子在提取前有时间达到空间一致性，显著提高分辨率（尤其对中等分子量范围）。
  • 反射器： 在漂移管末端加入一套静电场反射镜（由一系列电极构成）。具有相同质荷比但初始动能略高的离子会穿透反射器更深，飞行路径更长；动能略低的离子则反射得更快。这补偿了初始动能分散导致的飞行时间差，大幅提高分辨率（可达数万）和质量准确度（可优于百万分之几 - single digit ppm）。
  • 离子门： 用于选择特定 m/z 范围的离子进行后续分析（如 MS/MS）。

分子量测定的典型应用领域：

  1. 蛋白质组学：
    • 完整蛋白质分子量测定与确认（纯度、翻译后修饰初步筛查）。
    • 肽质量指纹图谱鉴定：蛋白酶解后产生的肽段混合物分子量测定，与数据库比对进行蛋白质鉴定。
    • 肽段精确分子量测定（用于从头测序）。
  2. 核酸分析：
    • 寡核苷酸的分子量测定与序列确认（合成质量评估、突变检测）。
    • 聚合酶链反应产物分析（基因分型）。
    • 核酸修饰研究。
  3. 合成高分子表征：
    • 聚合物分子量分布测定（数均分子量 Mn，重均分子量 Mw，分散度 Đ）。
    • 共聚物组成分析。
    • 端基分析。
    • 聚合反应机理研究。
  4. 生物小分子分析：
    • 糖类、脂类、代谢物等的分子量测定与结构推断。
  5. 微生物鉴定：
    • 提取微生物（细菌、真菌）的核糖体蛋白等特征蛋白，获得其独特的“蛋白质指纹图谱”（质谱谱图），通过与数据库比对实现快速、准确的种/株水平鉴定（临床微生物学应用广泛）。
  6. 成像分析：
    • 生物组织切片中特定分子（药物、代谢物、脂质、蛋白）的空间分布可视化。

测定分子量的关键步骤与注意事项：

  1. 样品制备： 选择合适的基质和溶剂至关重要。优化基质-分析物比例、点靶方式和结晶均匀性。
  2. 仪器校准： 使用已知精确分子量的标准品（如多肽混合物、蛋白质标准品、聚合物标准品）定期校准仪器，建立飞行时间与 m/z 的准确对应关系。高质量校准是获得准确分子量的前提。
  3. 参数优化： 调整激光能量、加速电压、延迟引出时间等参数以获得最佳信噪比和分辨率。
  4. 谱图解析：
    • 识别主峰：通常是 [M+H]⁺（正离子模式）或 [M-H]⁻（负离子模式）。
    • 识别加合峰：常见的有 [M+Na]⁺、[M+K]⁺、[M+NH4]⁺ 等。
    • 识别多聚体峰：如 [2M+H]⁺。
    • 识别碎片峰（相对较少）：可能来源于不稳定分子或过高激光能量。
    • 计算分子量： 从识别的准分子离子峰 [M+X]⁺/⁻ 的 m/z 值中减去（正离子）或加上（负离子）加合物的质量（如 H⁺ = 1.0078 Da），得到中性分子的精确分子量 M。
    • 校准与质量准确度： 最终结果的准确度高度依赖于校准的质量和标准品的准确性。
  5. 复杂混合物： 对于复杂样品（如全蛋白提取物、聚合物混合物），谱图可能包含多种组分信号，需要结合分离手段或仔细解析。

总结：

MALDI-TOF MS 凭借其独特的软电离特性、宽质量范围、高灵敏度和相对简便的操作流程，在分子量测定领域发挥着不可替代的作用。它能够快速、准确地提供生物大分子和高分子的分子量信息，是生命科学、材料科学、化学等领域进行分子表征、结构确认、质量控制和组学研究的关键工具。理解其基本原理、熟练掌握样品制备、仪器操作和谱图解析方法对于获得可靠、精确的分子量数据至关重要。